DB32-T 3762.16—2021新型冠状病毒检测技术规范 第16部分：核酸数字PCR法.docxVIP

DB32/T 3762.16—2021 PAGE II 新型冠状病毒检测技术规范 第16部分：核酸数字PCR法 范围 本文件规定了新型冠状病毒核酸数字PCR检测方法。 本文件适用于新冠病例、一般人群和重点人群的生物样本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血标本、肛拭子等，以及其他需要检测的样本的核算数字PCR检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 DB 32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 术语和定义 本文件没有界定的术语和定义。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字PCR：数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction） ORF1a/b：开放阅读框1a/b（open reading frame） dNTPs：脱氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 人RNase P基因：人核糖体核酸酶基因（Ribonuclease P） 原理 一种对核酸分子进行绝对定量的实验技术，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子。在每个反应单元中分别对目标分子进行 PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，进而计算出原始样本中目标分子浓度。 目前数字 PCR 技术包括芯片式和微滴式两种，芯片式通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，该方法具有稳定性好，均一性好的优点，但检测成本相对较高。微滴式通过产生微小油包水体系实现体系的分割，该方法有反应速度快，检测成本低的优点。为了实现对新型冠状病毒核酸数字PCR的定量检测，本标准通过数字PCR的扩增反应直接得出新冠病毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的拷贝数。 基本要求 实验室资质及级别 检测工作应在BSL-2级实验室进行。生物安全要求遵照 GB 19489 和 DB 32/T 3762.3 规定执行。 操作人员资质及防护 实验过程中的个人防护遵照 GB 19489 第8条和 DB 32/T 3762.3 规定执行。 试剂与材料 新冠病毒核酸提取试剂盒：应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取。 新冠病毒数字PCR预混液：含有镁离子，dNTPs、RNA酶抑制剂、逆转录酶和 DNA 聚合酶等组分的数字 PCR预混液，推荐根据不同的数字 PCR 方法和仪器选择不同的试剂。 引物序列和探针：检测新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探针序列见表1。 新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探针序列 标靶 名称 序列 新型冠状病毒ORF1ab基因 上游引物 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 下游引物 ACGATTGTGCATCAGCTGA 探针 5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3 新型冠状病毒N基因 上游引物 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 下游引物 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 探针 5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3 仪器与设备 生物安全柜。 生物安全型离心机。 涡旋振荡器。 恒温金属浴。 核酸提取仪。 数字PCR仪。 操作步骤 样本前处理 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.1 规定执行。 核酸提取 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.2 规定执行。 数字PCR扩增方法 数字PCR反应体系 数字PCR仪反应体系的总体积根据不同厂家、不同型号的仪器设备需进行相应的调整，并保持各引物探针组分终浓度不变。 数字PCR反应程序 数字PCR反应程序如表2，不同方法和不同仪器设备及试剂反应程序可能存在差异，需进行调整。 数字PCR反应程序 步骤 温度 时间 循环数 1 50 ℃ 60 min 1 cycle 2 95 ℃ 10 min 1 cycle 3 95 ℃ 30 s 40 cycles 55 ℃ 1 min 4 98 ℃ 10 min 1 cycle 5 4 ℃ 5 min 1 cycle 对照数字PCR反应的设定 试验中应设置阳性对照和阴性对照。用含 2019-nCoV ORF1ab 基因特异片段的病毒样颗粒、含 2019-nCoV N基因特异片段的病毒样颗粒和含人 RNase P 基因特异片段的质粒作为阳性对照。用无核酶水作为阴性对照。 质量控制与结果分析 质量控制 以下要求其中一条不符合，应重新进行试验，重新进