动物细胞培养.pptxVIP

动物细胞培养基本技术;细胞培养的甚本概念;细胞培养：使用细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫;培养细胞的特性;贴附型细胞;;;动物细胞体外培养特点;;;;培养要严格在无菌条件下进行，细菌、真菌、病 毒、或其它细胞均可导致培养物的污染。;培养细胞生长的条件;实验室;实验准备; 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用于玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 ;超净台;滤 器;; CO2培养;自动双重纯水蒸馏器 纯水仪;酶标仪 微孔板震荡器;培 养 板; 培养瓶;;;;常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干;2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml;消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 ;培养基;合成培养基;血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 ;一般说来．含5％小牛血清的培养基???大多数细胞可以维持 细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清 中的复杂成分至今尚未完全清楚． 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制 因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映 的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切 需要用无血清培养基培养细胞．;无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充 各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁 和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组 成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细 胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培 养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、 可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯 和鉴定各种细胞产物的程序。;向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特 的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一 种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 ;血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌;抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存 在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素 最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定;完全培养基的组成;培养基的配制;每代贴附生长细胞的生长过程;游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质 回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时