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激光扫描共聚焦显微镜 第一页，共三十二页，2022年，8月28日 激光扫描共焦显微镜的设计特点: 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 4. 激光作为光源 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 第二页，共三十二页，2022年，8月28日 Fluorescent Microscope Objective Arc Lamp Emission Filter Excitation Diaphragm Ocular Excitation Filter Objective Laser Pinhole Excitation Pinhole PMT Emission Filter Excitation Filter Confocal Microscope 第三页，共三十二页，2022年，8月28日 人眼分辨率： 0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25mm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：0.18mm 第四页，共三十二页，2022年，8月28日 电子显微镜的缺点： 1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 荧光显微镜的缺点: 1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠 第五页，共三十二页，2022年，8月28日 激光共聚焦显微镜的应用 单、双、三,四色标记检测。 精确的一、二、三、四维观察。 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。 静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动性等)。 定性以及定量分析。 光谱扫描,ROI扫描. 特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。 第六页，共三十二页，2022年，8月28日 时间分辨和快速扫描动态图像 出色的反射光图像 明场，DIC, 相差和透射光图像 单标，双标和三标图像 激光共聚焦显微成像技术的应用 第七页，共三十二页，2022年，8月28日 一.定位、定量 免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量 如：细胞膜受体或抗原的分布， 微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与 共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI 荧光原位杂交： 染色体基因定位 单细胞凝胶电泳 GFP的表达 活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量 活细胞内pH的定量、膜电位的测量 活细胞内自由基水平的定量 第八页，共三十二页，2022年，8月28日 Hela green-中心体 red- 纺锤体 Immuno-fluorecence label 第九页，共三十二页，2022年，8月28日 二.光学切片和三维重组 光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。 第十页，共三十二页，2022年，8月28日 显微CT与三维重组 第十一页，共三十二页，2022年，8月28日 3D reconstruction 第十二页，共三十二页，2022年，8月28日 三.动态测量 游离Ca2+, Mg2+、K+、Na+测量 pH值的检测 自由基的检测 第十三页，共三十二页，2022年，8月28日 相对 测量 程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间 序列的扫描测量 ?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) 第十四页，共三十二页，2022年，8月28日 四.细胞膜电位的测量 标记膜电位探针(慢反应）： JC1 510nm 530/590nm Dioc5(3) 548nm 573nm Dioc6(3) 484nm 500nm