理论聚合酶链式反应PCR及引物设计.pptVIP

理论聚合酶链式反应PCR及引物设计; 聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及实验操作 PCR引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）;聚合酶链式反应（PCR）;实验目的;聚合酶链式反应（PCR）;实验原理;PCR技术原理;PCR技术原理;PCR技术原理;; PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？ ;实验原理;引物设计的原则;引物设计的原则;引物设计的原则;引物设计的原则;实验原理;1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性 0.5 ～ 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性 2. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.5 ～ 2.5 μM ; 3. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.1 ～ 1 μM 4. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl;5. Taq DNA 聚合酶 耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 6. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 ;实验原理;常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。; 操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl dNTPs: 1.0μl×6 = 6.0μl 引物P1： 1.0μl ×6 = 6.0μl 引物P2： 1.0μl ×6 = 6.0μl Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 22.8μl × 6 = 136.8μl 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。;2. 另取 5 支0.2ml PCR管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支PCR 管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪 ;实验原理;⑴ 变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。??据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 ; ⑵ 退火温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。 退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。 设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！ ; ⑶ 延伸温度和时间： 延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间，常用72 ℃ 延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min 延伸时间过长可出现非特异扩增。 ; ⑷ 循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 ～ 3