培养基的制备程序.docxVIP

培养基的制备程序不同类型培养基制备的程序也不尽相同。但一般培养基的程序主要可分为：配料、溶化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定等 8 个步骤。 （一）配料 按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成分， 以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。 （二）溶化 将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。 （三）矫正 pH 1.pH 测定 取与标准管同口径的试管（通常用华氏试管）3 支，于第 1、3 管各加入欲测定pH 的的培养基 5ml，并于第一管中加入 0.2g／L 的酚红 0.25ml 作为测定管，混匀；于第 2 管加入蒸馏水 5ml，第 4 管为pH 标准比色管。 pH 的校正 若测定管过酸或过碱可用 0.1mol／L 氢氧化钠或 0.1mol／L 盐酸溶液矫正，直至颜色与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加 1 滴后要充分混匀，比色后再加第 2 滴（有时仅加半滴）准确记录加入的量。 计算 设 5ml 培养基矫正pH 至 7.4 时需 0.1mol／L 氢氧化钠 0.15ml，现有培养基 4990ml，需加氢氧化钠的量可按下列方法计算：5∶4990＝0.15∶X X＝0.15×4990/5＝149.7（ml） 如将此 0.1mol／L 的氢氧化钠改用 1mol／L 的氢氧化钠时，则需 14.9ml 即可。 （四）过滤澄清 培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下： 液体培养基 液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白（1000ml 培养基用 1 个鸡蛋白）在 100℃加热后保持 60～70℃40～ 60 分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以滤纸过滤。 固体培养基 如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用 自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压（103.43kPa）蒸汽 融化 15 分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。 （五）分装 根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容器的2 ／3 以免灭菌时外溢。 琼脂斜面分装量为试管容量的 1／5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管长的 2／3. 半固体培养基分装量约为试管长的1／3，灭菌后直立凝固待用。 高层琼脂分装量约为试管的 1／3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。 液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1／3. 琼脂平板：将灭菌（或加热融化）后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌 平皿内，内径9cm 的平皿倾注培养基约 13～15ml，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部， 待凝固后即成，倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。 新制成的平板培养基（简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于 37℃培养箱内约 30 分钟待平板平面干燥后使用。 （六）灭菌 不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别， 一般培养基少量分装时高压（103.43kPa）灭菌 15 分钟即可，培养基分装量较大时，可高压（103.43kPa）灭菌 30 分钟，含糖的培养基高压（55.16kPa）灭菌 15 分钟。以免糖类被破坏。 （七）检定 每批培养基制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37℃温箱内培养 24 小时后， 证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使 用。 （八）保存 制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在 4℃冰箱内备用。