DB22T 2984-2019鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法.docxVIP

ICS 11.220 B 41 吉 林 省 地 DB22 方 标 准 DB22/T 2984—2019 鹿粘膜病双抗夹心 ELISA 检测方法 Double antibody sandwich ELISA method for the detection of deer mucosal disease 2019 - 05 - 27 发布 2019 - 06 - 17 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 I DB22/T 2984—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。 本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、 付晓霞、王雨千。 1 DB22/T 2984—2019 鹿粘膜病双抗夹心 ELISA 检测方法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照 GB 19489 执行。 1 范围 本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作 步骤和结果判定。 本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鹿粘膜病 mucosal disease 由病毒性腹泻病毒(mucosal disease virus， MDV)引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现， 主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。 4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.1 PBS，见表 A.1。 4.2 包被液，见表 A.2。 4.3 洗涤液，见表 A.3。 4.4 封闭液，见表 A.4。 4.5 pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表 A.5。 4.6 底物溶液(OPD-H2O2)， 见表 A.6。 4.7 终止液，见表 A.7。 4.8 标准阳性，MDV NADL 国际标准株用牛肾继代细胞 MDBK 株培养增值，经反复冻融后制备。 4.9 标准阴性，pH7.4 PBS。 4.10 MDV 免疫球蛋白，见附录 B。 2 DB22/T 2984—2019 4.11 MDV 酶标抗体，见附录 C。 5 仪器设备 5.1 离心机，最高转速 15 000 r/min。 5.2 恒温培养箱，温度均匀度≤±1(37 ℃时) 5.3 酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。 5.4 紫外分光光度计，200 nm~1 000 nm。 6 样品处理 6.1 样品采集 选择新鲜鹿粪 3 g ~5 g 装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有 冰块的保温瓶(箱) 内。每份样品的包装瓶(袋) 上均要贴上标签， 写明采集地点， 编号， 时间等。如 暂时不进行检测应－80 ℃保存。 6.2 样品处理 取 1 g 采集到的鹿粪样品加入10 mL PBS(5.1)中充分混匀，3 000 r/min离心(6.1)30 min， 上清液即为待检样品。 7 操作步骤 7.1 使用前将所有试剂恢复至室温。 7.2 在 ELISA 反应板中加入用包被液(5.2)稀释至 1.0 mg/mL MDV 免疫球蛋白(5.10) 100 μL/孔， 37 ℃(6.2)包被 4 h。 7.3 弃去板中溶液，加洗涤液(5.3)300 μL/孔，轻微晃动反应板，3min 后弃去洗涤液；如此操作 3 次，最后将 ELISA 反应板置于吸水纸上轻轻拍干。 7.4 然后加封闭液(5.4)100 μL/孔，37 ℃ 封闭 1 h。 7.5 重复 7.3 的操作。 7.6 加入待检样品 100 μL/孔，并设阳性对照(5.8) 2 孔，阴性对照(5.9)2 孔，空白对照 1 孔，密 封 ELISA 反应板，37 ℃ 孵育 2 h 。 7.7 重复 7.3 的操作。 7.8 加入酶标抗体(5.11) 100 μL/孔， 密封 ELISA 反应板，37 ℃ 孵育 1 h。 7.9 重复 7.3 的操作。 7.10 避光环境