第酵母基因工程基因工程原理与技术课件.pptVIP

酿酒酵母表达载体 目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp) （见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp) ；（4）酵母整合型质粒 (YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序列，能够自主复制，通常为多拷贝数 现在是31页\一共有53页\编辑于星期五 酿酒酵母宿主 有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。 现在是32页\一共有53页\编辑于星期五 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶 ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工 rgr 1 提高重组蛋白表达 转录水平 ose1 提高重组蛋白表达 转录水平 ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y rho- 提高重组蛋白表达 转录水平 突变类型 生物效应 作用位点 现在是33页\一共有53页\编辑于星期五 酿酒酵母宿主 为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。 现在是34页\一共有53页\编辑于星期五 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 能抑制超糖基化的突变类型 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天冬酰胺侧链糖基化缺陷型 och 外侧糖链添加缺陷型 突变类型 生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。 现在是35页\一共有53页\编辑于星期五 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 蛋白酶体 Lys HOOC Ubiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lys ubiquitin ligase E3 Lys 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 现在是36页\一共有53页\编辑于星期五 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌有四个泛素编码基因： UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达 酵母菌有七个泛素连接酶基因： UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7 现在是37页\一共有53页\编辑于星期五 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 UBI 4缺陷型： 外源基因表达理想的受体 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， UBA 1缺陷型：减少蛋白降解 UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型： 减少蛋白降解 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效 现在是38页\一共有53页\编辑于星期五 第酵母基因工程基因工程原理与技术课件演示文稿 现在是1页\一共有53页\编辑于星期五 优选第酵母基因工程基因工程原理与技术课件 现在是2页\一共有53页\编辑于星期五 作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求 ①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容