实验植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳.pptxVIP

实验植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳;【实验目的】 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理； 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； 3. 学习过氧化物酶同工酶的检测方法。;【实验原理】;; PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出酶谱。 ; 为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。; 过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。;【器材与试剂】;【实验步骤】; （二）凝胶的制备 1.准备工作： （1）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。 （2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。 ;3.制备小孔胶（分离胶） 取2个小烧杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3的比例，分别取A液、C液和水置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气5～10min，可见有气泡冒出。; 将2个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可 见水与胶之间有一界线，但很快消失。 将玻璃管垂直固定在一试管中， 置25～35℃温箱聚合30～60min，当再次看到水与凝胶之间的界线时，表示聚合完成。吸去表面的水。;4.制备大孔胶（浓缩胶） 取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于1:1.5:1:4的比例，分别取B液、D液和E液置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧??中，抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。25～35℃聚合20～30min，聚合后的大孔胶呈乳白色。仔细吸去表面的水。;（三）电泳1.安装电泳槽：向电泳槽下槽加入适量甘氨酸－Tris电泳缓冲液。去掉玻璃管下端的封口膜，将玻璃管固定在电泳槽上，阴极在上，阳极在下。;2.点样：取样品50μL，蔗糖－溴酚篮50μL, 混匀，加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖的电极。排除玻璃管下端口的气泡，连接好电泳仪。;3. 电泳：开始电流为2~3mA/管，当样品至分离胶时，电流加大到4~5mA/管。当溴酚蓝指示剂接近管底时切断电源，终止电泳。;4. 剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。;（四）染色： 临用时配制染色液：（10 ml ） 联苯胺母液 0.5 ml H2O 9.3 ml 3% H2O2 0.2 ml 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过胶条）。约10min后用自来水冲洗。;（五）记录并计算： 观察、记录酶谱，并计算各同工酶的相对迁移率。;【要点提示】;感谢您的欣赏