临床分子生物学检验技术--医学院课件.pptx

1;《临床分子生物学检验技术》;分子生物学检验技术;4;5;广义的探针是指所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。 核酸探针（nucleic probe）:是指带有可检测的标记标记，并且能够与靶序列发生特异性互补杂交的核酸分子。;1.DNA探针 基因组DNA探针 cDNA探针 DNA探针通常为400～500个碱基 2.RNA探针 3.寡核苷酸探针 人工合成，长度一般17~50个核苷酸。检测点突变和小段碱基的缺失或插入。;（1）放射性标记物 放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18~10-4g的物质； 很高的特 异性，假阳性结果较少。 缺点：辐射危害（易造成放射性污染） 同位素的半衰期限制 ;（2）非放射性标记物 ;（1）随机引物法 （2）DNA缺口平移标记 （3）全程RNA探针标记 （4）化学法全程标记 （5）3’末端标记 （6）5’末端标记;（1）随机引物法 其原理是利用随机引物（长6个核苷酸的寡核苷酸片段）能与各种单链DNA模板结合，在无5??3?外切酶活性的 DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）的催化下，按5??3?方向合成一新的DNA链，将放射性标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。 ;12;枯草杆菌蛋白酶(或胰蛋白酶);原理：利用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。;DNA缺口平移标记法探针长度取决于DNase I和DNA聚合酶I的比例。;采用质粒载体转录的方法制备RNA探针，最受欢迎的是含有两种不同启动子的载体，可以从两个方向合成RNA，使得可以从同一个质粒中获得正义和反义的RNA。;;用化学反应将酶连接到探针上，探针片段大小在标记过程不改变，目前用得最多的是生物素和地高辛。 ;在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个标记的[α-32P]dNTP。 3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程。 常用酶：Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记法。;先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使 ATP分子上的γ磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’-OH基团上。因此采用γ-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5’端标记。 ;21;固相杂交 Southern 印迹杂交（Southern blot） Northern 印记杂交（Northern blot ） 反向点杂交（reverse dot blot，RDB） 液相杂交 原位杂交;固相杂交是将待测 的靶核苷酸链预先固定在固体支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，而 标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应 后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。 常用的固相杂交类型有印迹杂交、组织原位杂交、 斑点杂交、菌落杂交等。 ;24;Southern杂交的主要步骤： 1）待测核酸样品的制备 2）待测DNA样品的电泳分离 3）凝胶中DNA的变性：碱变性（NaOH溶液） 4）Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5）Southern杂交 6）杂交结果的检测 ;26; Southern杂交 的主要应用 1.单基因遗传病诊断 　　 2.基因点突变检测 　　 3.PCR产物分析;1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 因这种方法与Southern blot 杂交技术十分类似，被称为Northern杂交。基本原理和基本过程与Southern blot基本相同。 鉴别RNA 探针可用DNA或RNA片段 待测样品为总RNA或mRNA ;反向点杂交（reverse dot blot, RDB）是1989年Saiki等提出的一种斑点杂交技术。 ;30;液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。液相杂交是研究最早的杂交类型。 ;原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，利用组织化学或者免疫组化的方法在显微镜下进行细胞内定位的技术称原位杂交（in situ hybridization）。 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究； 不需从组织或细胞中提取核酸，灵敏度高； 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。 ;33;（一）放射性标记探针检测 1.放射自显影 2.液体