感染性疾病的分子生物学检验技术-遗传学疾病的分子生物学检验技术-医学院课件.pptx

感染性疾病分子生物学检验技术遗传性疾病的分子生物学检验技术 感染性疾病是由特定病原体感染机体后所产生的一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生虫等。 可采用微生物学、生物化学、免疫学和血液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴定等方面还存在着较大的缺陷。 随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势，并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。第十章 病毒病的分子生物学检验第一节 病毒病分子生物学检验策略一、病毒感染的一般性检出策略一般性检出策略，只能提供是否存在某种病毒感染，通过常用核酸杂交或PCR 技术直接检出病原体的核酸，是快速诊断机体有无病毒感染的首选方法。可以根据病毒本身的保守序列设计PCR引物或制备特异性探针。二、病毒感染的完整性检出策略 完整性检出策略，不仅对病原体的存在与否做出明确判断，同时能够诊断出病毒携带者和潜在感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、基因分型（包括亚型）检测和耐药性鉴定。 常采用核酸杂交、PCR、基因芯片和DNA测序等技术。第二节? 乙型肝炎病毒的分子生物学检验乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携带者，我国约50％-70％的人群感染过乙肝病毒，其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝癌发病率也在增加。HBV 感染后可以引起急性、慢性病毒肝炎，而且与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的关系。一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征乙型肝炎病毒基因组结构HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是已知可感染人类最小的DNA病毒。基因组长为3.2k,HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：携带有病毒全部的编码信息，模板编码病毒蛋白；短链为正链S(+)：在不同的分子中长度不等，约负链的50%～100%。HBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个可读框（ORF)，其中S、C、P、X 4个ORF是早已公认的。HBV DNA为了能在细胞内独立复制，其编码区有广泛的重叠，以扩允其编码容量。多个ORF可读码2次以上，编码2个以上蛋白质。S基因区分为：前S1区、前S2区和S区。编码外膜蛋白，前S区与病毒的嗜肝性有关。其中S基因编码外膜主蛋白（即S蛋白）是乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的主要成分。1、S基因区C基因区分为前C区和C区两部分。C区由459 个核苷酸组成，编码产物为183 个氨基酸残基组成的多肽序列，称为乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）；由前C基因和C区编码212氨基酸残基组成的多肽称为乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。2、C基因区是HBV DNA中最大的一个ORF，与其他基因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒DNA的多聚酶蛋白(HBV DNAP）。 通过研究P基因的结构与功能，可进一步探索抗HBV治疗的新方法。3、P基因区是HBV DNA中最小的一个ORF，编码产物为x 蛋白(HBxAg)。 可能是一种反式激活因子，与病毒基因组的表达调控及 HBV DNA 的整合有关。x蛋白所诱生的抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。4、X基因区传染性HBV病毒颗粒传染性HBV病毒颗粒HBsAg 包膜DNA聚合酶部分双链DNA逆转录酶负链DNA包裹后的前基因 mRNAA(n)cccDNAmRNA肝 细 胞二、乙型肝炎病毒的分子生物学检测方法（一）乙型肝炎病毒DNA的检验HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志。定量检测HBV DNA对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药物疗效等有重要意义。cccDNA半衰期长，在体内难以清除，因此检测cccDNA对于了解病毒的复制和感染有同样的价值。HBV-DNA 常用的分子生物学检验方法1、PCR法?传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的复制程度，为临床提供从分子水平上对病原体进行诊断提供依据。2、核酸分子杂交 将待测标本点状加样于硝酸纤维素薄膜上，与标记的HBV DNA寡核苷酸探针进行斑点杂交，从而检测待测标本中是否存在HBV DNA。以下不能对探针进行标记的物质是？A： 生物素B ： 多糖C： 磷32D ：地高辛3、荧光定量PCR法荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。4、支链DNA技术 (bDNA技术)?bDNA技术的最大特点是对目标核酸直接进行检测，放大倍