蛋白质组学技术-医学院课件.pptx

第八章 蛋白质组学技术蛋白质组（proteome）是指一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质。是特定时间和空间条件下所有蛋白质的集合，是动态变化的总和。蛋白质组学（proteomics）以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分，表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。第一节 蛋白质凝胶电泳与检测一、蛋白质凝胶电泳蛋白质凝胶电泳是重要的生物化学分离纯化技术，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)是目前分离蛋白质最可靠的技术之一。（一）蛋白质的SDS十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 是根据蛋白质分子量差异分离蛋白质的分离纯化技术。SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，带有大量负电荷，蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。强还原剂β-巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。SDS示意图通过SDS估算蛋白质的分子量（Mr）蛋白质在SDS中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。（二）非变性蛋白质凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE) 是在不加入SDS和巯基乙醇等条件下进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于分离蛋白质、核酸等生物大分子，用于同工酶分析等。二、凝胶上蛋白质的固定与检测（一）考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝可与蛋白质非共价键结合，与蛋白质的碱性基团可逆结合，最常用的蛋白质染色方法。优点：染色重复性好，操作简便，不影响后续质谱鉴定缺点：灵敏度低于银染和荧光染色。（二）银染色 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈现棕黑色。 优点：灵敏度高，是考马斯亮蓝的100倍 缺点：操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝。（三）荧光染色近年来兴起的技术。利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。优点：染色方法简便，灵敏度高，不影响后续的质谱鉴定。缺点：价格昂贵，荧光易淬灭。考马斯亮蓝染色银染色荧光染色三、蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹蛋白质印迹（Western blotting）：又称免疫印迹杂交，即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带，是检测蛋白质表达的方法。蛋白质样本制备SDS－PAGE电泳蛋白质转移目标蛋白的免疫学检测 目标蛋白质的显示（二）蛋白质免疫印迹的方法特点基本操作步骤：1. 蛋白质样品的制备材料的获取：裂解细胞→蛋白质溶解状态→蛋白酶抑制剂（抑制蛋白的降解）可利用的材料： 细胞裂解液 细胞蛋白质提取液 纯化的蛋白质2. SDS为更好的分离蛋白质，Western blotting多采用不连续的SDS电泳，不连续体系积层胶（浓缩胶）及分离胶所组成。浓缩胶是大孔胶，分离胶是小孔胶。浓缩胶的作用是浓缩和集中蛋白质，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（kD)1512-431016-687.536-945.057-212 凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同，浓度小的孔径大，浓度大的孔径小，一般分离胶用12%的，浓缩胶用5%的，因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同一起跑线上，然后一块进入分离胶分离。3. 蛋白质转移常用的固相支持物：硝酸纤维薄膜（nitrocellulose, NC），聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）作用方式：电转技术，靠疏水作用结合蛋白转膜液：三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸系统（Tris-Gly）4. 靶蛋白的免疫学检测4.1 封闭：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1～2h）4.2 靶蛋白与一抗结合：单克隆抗体，多克隆抗体及混合单克隆抗体4.3 显色：应用最广泛的是化学发光技术，它是替代放射性核素标记的一种高灵敏的检测方法，多使用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)作为二抗的耦联物。HRP可以催化底物3,3-二氨基