核酸实时定量检测技术之实时荧光定量PCR技术原理--医学院课件.pptx

1;实时荧光定量PCR技术（real time Q-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应过程，最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。;3;1. 扩增曲线是指对整个荧光定量PCR扩增过程进行了实时的监测和连续地分析，将监测到的荧光信号绘制成一条以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标的曲线。 ;2. 荧光阈值（threshold）设置在基线信号标准偏差× 10，当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。荧光阈值设置在PCR扩增的指数期。。;3.循环数（cycle threshold value, Ct值）即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数。Ct值可以相对判定起始模板量。;4.扩增效率（amplification efficiency，E）是指PCR反应一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值在0～1之间。 一般情况下，在PCR反应的前20个或30个循环，E值比较稳定，为指数扩增期，之后随着反应进行逐渐进入平台期，E值逐渐下降至0，不再扩增。;在PCR中，随着扩增反应循环次数的增加，模板以指数的方式进行扩增。 PCR扩增一定的周期后，扩增产物的总数量可以用以下公式来表示：理想的反应式：Yn=X·2 n 实际反应式：Yn=X·(1+E) n Yn：PCR产物的量 X：原始模板的数量 E：扩增效率 n：扩增反应的循环次数 ;在实时荧光定量PCR中，公式可表示如下： YCt=X·(1+E) Ct 整理得: Ct= -lgX/ lg (1+E)+ lg YCt/ lg (1+E) Yct：实时荧光定量PCR荧光扩增信号达到阈值线时扩增产物的量 对于每一个特定的PCR反应而言，E与YCt均为常数，Ct值与lgX成负相关，也就是说，初始模板的对数值与PCR的循环数呈线性关系，因此，可根据扩增达到阈值的循环数就可以计算出样品中所含靶基因的量。 ;10;11;实时荧光定量PCR中的荧光化学物质;SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 ;14;优点： 荧光染料的成本低； 无须对引物或探针进行预先特殊的荧光标记； 适用于任何反应体系，操作亦比较简单； 缺点： SYBR Green Ⅰ染料能与任何双链DNA结合，因此，它也会结合到非特异性扩增产生的双链分??或引物二聚体中，使实验产生假阳性信号。 ;荧光共振能量转移原理（FRET）：当一个荧光基团与一个淬灭基团的距离接近一定的范围，就会发生荧光能量的转移，淬灭基团就能吸收荧光基团发生的荧光。 ;17;18;优点：该技术解决了荧光染料技术非特异的缺点，反应结束后无需进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间； 缺点：TaqMan探针两侧R基团与Q基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高； ;20;21;22;23;24;RT-PCR的概念； 实时荧光定量PCR常用的荧光染料及其作用机理； 实时荧光定量PCR的应用。;26;核酸序列分析，亦称核酸测序技术，简称测序（sequencing）是指分析特定RNA或DNA片段的碱基序列，确定其方向与结构，对突变进行定位、鉴定和比较研究。;28;第一代DNA测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。 70年代后期， Sanger建立了双脱氧链终止法， Maxam‐‐‐‐Gilbert等人建立了化学裂解法。;双脱氧链终止法测序原理 DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。 2’,3’-ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。 ;;1. 进行测序反应 在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，在ddNTP 的位置，链延伸终止。;33;34;35;36;37;38; 新一代(Next Generation Sequencing)测序技术可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为高通量测序(High‐throughput Sequencing)技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序(Deep Sequencing)。;一、基本原理和工作流程 第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头，随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，然后进行引物杂交和酶延伸反应。 所有克隆在同一平面上，