分子生物学研究法下.pptxVIP

分子生物学研究法下第1页/共94页 content一、基因表达研究技术第2页/共94页 content 1995年Velculescu等提出了基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)技术，能同时对上千个转录物进行研究。A. 基因表达系列分析技术第3页/共94页 contentSAGE的主要依据有两个。第一，一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分辨262144个不同的转录物(49)，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。第二，如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。第4页/共94页 content 以biotinylated oligo(dT)为引物反转录合成cDNA； 以一种限制性内切酶(锚定酶 Anchoring Enzyme， AE)酶切。 锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基(44)。 通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3′端部分。 对每一个mRNA只收集其polyA尾与最近的酶切位点之间的片段。SAGE的实验路线第5页/共94页 content 将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。 每一种接头都含有标签酶(Tagging Enzyme TE)酶切位点序列(标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链)。 接头的结构为引物A/B序列+标签酶识别位点+锚定酶识别位点。第6页/共94页 content用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段(约9～10碱基)，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签(Ditga)片段并克隆、测序。一般每一个克隆最少有10个标签序列，克隆的标签数处于10～50之间。对标签数据进行处理。第7页/共94页 content第8页/共94页 contentB.RNA的选择性剪接技术通过不同的剪接方式有一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程——RNA的选择性剪接平衡剪接5/选择性剪接3/选择性剪接外显子遗漏性剪接相互排斥性剪接第9页/共94页 content使用RT-PCR技术对不同组织来源的RNA样品进行扩增PCR产物是否存在大小差异测序，差异产生的原因是否是选择性剪接第10页/共94页 contentC.原位杂交技术原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。第11页/共94页 content 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。第12页/共94页 content为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定；具有能与特定片段互补的核苷 酸序列(即探针)；有与探针结合的标记物。第13页/共94页 content基因组原位杂交技术 　　基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究第14页/共94页 content荧光原位杂交技术 　　荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。 它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：-行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。 FISH技术检测时间短，检测灵