酶分析法学习课件.pptxVIP

酶 分 析 法教学目的和要求 掌握： 1．酶活力的测定方法 2．酶法分析的测定方法概 述1.酶的概念 酶是生物体内产生并具有催化作用的特殊物质，又称为生物催化剂。除极个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。性能远远超过人造催化剂。产物（product，P）底物（substrate，S ）2.酶的应用：在体外进行催化反应①用以制造某些产品②用以去除某些物质③用以识别某种化合物 ④用以测定某种物质酶是特殊的催化剂 (1) 生物大分子 (2) 催化条件温和 (3) 强酸、碱或高温下失活 (3) 高选择性 (4) 高催化效率概 述3.酶分析法包括两种类型：酶活力测定：以酶作为分析对象，底物过量酶法分析：以酶作为分析手段，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，底物是反应限制因素酶法分析的优点 用于复杂组分中结构或物理化学性质比较相近的同类物质的分离鉴定和分析。 特异性强、干扰少、操作简单、样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。 通过了解酶对底物的特异性，可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。 可用偶联反应。 无污染或污染很少的分析方法。第一节 酶活力测定法 一、基本概念 二、酶促反应的条件 三、酶活力的测定方法 四、测定过程中应注意的问题 一、基本概念酶活力 (enzyme activity) 指在一定条件下，酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定：是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶活力测定的目的：通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量酶催化的反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。反应速度越快，酶的活力愈高。在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。酶活力大小可用酶活力单位表示1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”U 来表示酶活力，规定为：在最适反应条件下，每分钟内催化1mmol底物转化为产物所需的酶量，定义为一个酶活力单位。酶的比活力：每mg酶所含的酶活力单位数酶分析法的检测方法最常用的方法介绍如下：(1) 紫外-可见分光光度法(2) 荧光分析法(3) 旋光度法(4) 酶偶联测定法(5) 其他检测法1、紫外-可见分光光度法 NAD+ (烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I) 和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II )是维生素烟酰胺的衍生物，还原氧化NAD+NADH300-400nm无吸收在338.5nm与340.5nm之间有一个最大吸收峰例 1、丙酮酸+NADH+H+乳酸+NAD+LDH例 2、GOT谷氨酸+草酰乙酸天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸MDH草酰乙酸+NADH+H苹果酸+NAD+2、酶偶联测定法酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的“偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。①被测反应偶联指示反应二、酶促反应的条件基本要求：反应系统中除了待测酶的浓度是影响速度的惟一因素外，其他因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。确定反应条件时应考虑： （1）底物 选用的底物在物理化学性质上和产物不同。 一般选用底物的浓度[S]=100 Km 一般选择Km小的作测定的底物。米氏常数Km：酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度，重要的酶反应动力学常数乳酸脱氢酶（2）pH值 注意选择适宜的反应pH值，并将反应维持在这一pH值。例：丙酮酸 乳酸 pH对酶反应的影响 （3）温度 实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。酶反应的温度通常选用25℃、30℃、37℃。（4）辅助因子 为了提高酶在反应系统中的稳定性，有些也需要某些相应的物质（5）空白和对照 空白指杂质反应和自发反应引起的变化量，提供未知因素的影响对照作为比较或标定的标准。三、酶活力的测定方法（一）取样测定法（二）连续测定法（一）取样测定法1.取样测定法：求得单位时间内酶促反应变化量的方法。2.常用的检测方法：紫外-可见分光光度法、荧光分析法等。取样测定法 在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法（添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。取样测定法取样测定法一直沿袭至今是因为：不需要特殊仪器几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体的测定方法由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。3、终止酶反应：添加酶的变性剂三氯醋酸：紫外光区有吸收高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用 （二）连续测定法1.连续测定法：基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。 连续测定法的准确