第五章_目的基因的获得(1).pptVIP

三、目的基因的获得 染色体步移 　　通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因 本章重点掌握的内容 目的基因的概念 基因文库的概念及构建基因文库的基本程序 基因组文库的概念及操作步骤 cDNA文库的概念及操作步骤 基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点与异同点 目的基因的分离方法及主要特点 OVer!!!! * * * * * 三、目的基因的获得 目的基因的分离方法 　1.直接分离法 　（2）物理化学法 　　单链酶解法 GC63%rDNA Tm1 Tm2 Tm3 ＜ ＞ Tm2：97℃ S1酶切 得到rDNA 三、目的基因的获得 目的基因的分离方法 　1.直接分离法 　（2）物理化学法 　分子杂交法（Molecular hybridization) 　　ssDNA与其互补的核苷酸序列配对形成dsDNA，这就是分子杂交的原理。 　　　Beckwith et al. (1969)应用DNA-DNA分子杂交技术，分离得到了E. coli 的Lac operon的β-半乳糖苷酶基因。 缺点：仅在理论上有重要意义，在实践上很难应用 三、目的基因的获得 目的基因的分离方法 　1.直接分离法 　　　利用酶促反转录法分离基因：主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。 　　　 　　　 　　　例如：哺乳送物的网织红细胞中的珠蛋白mRNA（占总mRNA的 90%），用以上方法建立cDNA文库，得到珠蛋白基因。 mRNA cDNA dcDNA 三、目的基因的获得 　目的基因的分离方法 　　2.化学合成法 　　　1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 　　　化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 　　　 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 三、目的基因的获得 目的基因的分离方法 　2.化学合成法 固相磷酸三酯合成过程 DNA合成仪 三、目的基因的获得 　目的基因的分离方法 　　2.化学合成法 　　用途： 　　直接合成基因 　　　（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA 　　　（2）有些基因比较短，化学合成费用较低 　　合成引物（20mer左右） 　　合成探针序列 　　定点突变合成 　　　　合成带有定点突变的基因片断。 　　合成人工接头或衔接物 EcoRI Adaptor EcoRI Linker 三、目的基因的获得 目的基因的分离方法 　　3.基于PCR的分离法 　　PCR法定向扩增目的基因的基本原理 　　　PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 　　　使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 三、目的基因的获得 　目的基因的分离方法 　　3.基于PCR的分离法 　（1）直接从基因组中扩增 　　　提取基因组DNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　 　　　　　适合扩增原核生物基因。 　　　　真核生物基因组含有内含子！ 三、目的基因的获得 原核基因组部分 原核细胞 提取基因组DNA PCR扩增 三、目的基因的获得 　目的基因的分离方法 　　3.基于PCR的分离法 　（2）从mRNA中扩增: RT-PCR 　　　提取基因组 total RNA 　　　反转录合成总cDNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　适合扩增真核生物基因。 　　原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。 三、目的基因的获得 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的 基因cDNA第二链 PCR mRNA 目的基因 的引物2 三、目的基因的获得 　目的基因的分离方法 　　3.基于PCR的分离法 　（3）同源序列克隆法 　依据： 　　　自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。 　方法： 　　　根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。 三、目的基因的获得 三、目的基因的获得 根据已知基因序列或同源序列分离目的基因 三、目的基因的获得