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1 基因工程制药 Gene Engineering for Pharmaceutics 目的要求 1、掌握基因工程制药的基本过程。 2、掌握目的基因的获得方法，基因表达体系及不同表达体系的特点及高效表达的措施。 3、掌握质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。 4、掌握基因工程药物的分离纯化。 5、熟悉基因工程药物的质量控制。 课时与内容 Lesson 1：基因工程制药的基本过程 目的基因的获得方法 Lesson 2：基因表达体系及高效表达措施 Lesson 3：基因工程菌的不稳定性及基因工程菌培养 Lesson 4：基因工程药物的分离纯化 Lesson 5：基因工程药物的质量控制 学习内容 2.1、基因工程制药概述 2.2、基因工程制药的基本过程 2.3、目的基因的获得 1、Gene？ 2、Target gene？ DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi?Argonaute. Nature Biotechnology,34(2016) ,768–773 2.1 基因工程制药概述 基因工程技术： 是通过对Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质（germ plasmid）的重新组合，再借助Virus, bacterium, Plasmid or other Vectors,将Target gene转移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 进行Replication and Expression的技术。 基因工程主要研究任务： Gene isolation , synthesis, Incision , Recombinant , transformation and expression. 基因工程：生物技术的核心 基因工程最成功的成就：研制出用于生物治疗的新型药物 Question :为什么将基因工程技术引入制药领域？ 传统制药存在的问题： A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的应用特点： A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。 B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。 a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 2.2 基因工程药物生产过程 基因工程药物的生产分为 上游阶段 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。 下游阶段 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。 1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术： 制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。 主要包括: 工程菌大规模发酵最佳参数的确立 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 计算机的优化控制等。 基因工程药物制造的主要步骤 2.3 目的基因的获得 目的基因的获取途径： 一、逆转录法 二、反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR） 三、化学合成法 四、表型克隆筛选基因 五、改造基因 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification 细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离困难。 但是mRNA的3’末端常含有一poly A组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于Oligo-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。 2、cD