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α淀粉酶发酵提取和;一、实验目的
通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例,学习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提取纯化的基本原理和过程,掌握α-淀粉酶分析方法、发酵和提取的评价标准。
;二、实验原理
1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉淀法,即:通过加入不同的金属盐破坏酶的水化层同时中和酶的表面电荷,而使酶快速的形成沉淀,得到分离纯化。本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适量的硫酸铵,对发酵液中的胞外α-淀粉酶进行纯化提取。 ;2. 在碱性溶液(NaOH)中,双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键(-CO-NH-),因此,蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸收值在一定范围内与蛋白质的质量成正比.;3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶作用于淀粉时,可从分子内部切开α-1,4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原糖在碘液中不显色,故可通过预先盛有淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化(由紫色变棕色)来辨别反应终点。;三、实验步骤
1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉酶。
先将固体硫酸铵研成细粉末,然后按37%(重量/体积比)的比例加入到经离心的发酵液中,混合均匀, 静置30min。
具体操作:5ml发酵液,加1.87克硫酸铵细粉末,混匀, 静置30min.
两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离子水溶解。(即稀释一倍)
注意:(剩下的溶液留下来用于下一次测蛋白含量)
; 2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线
取7支试管,编号,按下表加入试剂:
震荡15分钟,室温静置30分钟后,540nm比色,以蛋白质含量(mg/ml)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
;2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍)
3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并计算它们各自的酶比活力
α-淀粉酶的酶活测定
(1)吸取1ml标准糊精溶液,置于盛有3ml标准稀碘液的试管中
(2) 在试管中加入2%可溶性淀粉20ml,加缓冲液5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入0.5ml???释酶液,立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预先盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中),当颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色相同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组各做2个重复)
;计算:
酶活性单位:以1克酶粉或1ml酶液于60度,pH为6.0的条件下,在1小时内液化可溶性淀粉的克数表示
淀粉酶活力单位=(60/t *20*2%*f)/0.5=48*f/t
试中f表示酶的稀释倍数,t为反应时间
活性回收率=(提取液酶活×提取液体积)/(发酵滤过液酶活×用于盐析沉淀的发酵滤过液体积);四、? 思考题
1.活性回收率通常小于1,有没有可能大于1,为什么?
2.双缩脲法测定蛋白质质量,只与待测蛋白质质量有关,而与分子量无关,为什么?
实验报告
清洁
;感谢观看!
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