细胞培养的常见问题及解决方案.pptxVIP

细胞培养的常见问题及解决方案;两种实验的优缺点;问题零：我可以养细胞吗？;问题一：怎样做到不污染？;问题一：怎样做到不污染？;问题一：怎样做到不污染？;问题二：怎样观察活细胞和死细胞;;;;问题二：怎样观察活细胞和死细胞;;问题三：细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？;问题三：细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？;问题四：细胞消化时怎样掌握火候;问题四：细胞消化时怎样掌握火候;问题五：悬浮细胞如何传代？;问题六：细胞在培养过程中经常出现一些黑点点，是污染吗？;;问题七：培养中黑点点是怎么形成的？;如何防止黑点点是的生成？;如何处理黑点点？;问题八：怎样让细胞适应新的条件？;;支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。;为确定有无支原体污染可做如下检测：①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一???，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂 有专门的去除支原体的试剂，在培养液中加入试剂后传代培养3星期左右就可以去除。我是因为在做免疫荧光的时候在显微镜下看到有支原体污染，然后加mycoplasma remove reagent大约过了3星期在用的时候就没有支原体污染了。;;感谢观看!