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ch基因工程工具酶第1页/共88页第2页/共88页3.1限制性内切酶(Restriction Endonuclease)3.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）现象限制：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。修饰：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。第3页/共88页3.1.2 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。第4页/共88页第5页/共88页3.1.3 限制性核酸内切酶的命名原则① 第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus) ② 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)③ 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)④ 罗马字母表示发现和分离的先后顺序第6页/共88页限制性核酸内切酶的命名原则：属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第7页/共88页3.1.4 限制与修饰系统的种类 Ⅱ 型（type Ⅱ）： 限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体， 93%Ⅰ 型（type Ⅰ）： 限制酶、甲基化酶识别 DNA 序列的 S 亚基 ， 1% Ⅲ 型（type Ⅲ）：不到 1% 第8页/共88页3.1.5 限制酶识别的序列 3.1.5.1 限制酶识别序列的长度及结构 ?限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基 ?4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ?5 个：EcoRⅡ?NciⅠ 6 个：EcoRⅠ?HindⅢ?7 个：BbvCⅠPpuMⅠ?8 个：NotⅠ ?SfiⅠ第9页/共88页第10页/共88页限制酶识别序列的结构 （1）限制酶识别的序列大多数为回文对称结构（2）识别序列不是对称的（3）可识别多种序列 ?第11页/共88页3.1.5.3 酶切位点（1）限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部（2）位点偏爱（Site preference）?位点偏爱：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。（3）酶切位点在基因组中分布的不均一性（4） 酶切位点的引入第12页/共88页3.1.6 限制酶产生的末端（1）限制酶产生匹配粘端（matched ends）（2） 限制酶产生平末端（Blunt end） （3） 限制酶产生非对称突出端 （4） 同裂酶（5） 同尾酶 第13页/共88页第14页/共88页第15页/共88页第16页/共88页3.1.7 酶切反应条件Tris-HCl 50mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LNaCl 0-100mmol/LDTT 1mmol/LVolume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶第17页/共88页3.1.7.1 缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值（7.0-7.9 ）的缓冲剂、 Mg++ 、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA。3.1.7.2 反应温度大多数为 37℃第18页/共88页3.1.7.3 反应时间 反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。3.1.7.4 终止酶切的方法EDTA 加热第19页/共88页3.1.7.5 影响酶活性的因素 ① DNA样品的纯度② DNA样品的甲基化程度③ 酶切反应的温度④ DNA分子结构（底物构象）⑤ 核酸内切酶的缓冲液第20页/共88页3.1.8 星星活性（star activity）Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。第21页/共88页星星活性产生的原因如下： ① 反应体系中甘油的浓度过高 ② 酶用量过大 ③ 低离子强度 ④ 高pH ⑤ 含有机溶剂 ⑥ 非Mg2+的二价离子的存在。第22页/共88页3.1.9 Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途① 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段② 建立DNA分子的限制酶图谱③ 构建基因文库④ 用限制酶切出的相同粘性末