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基因工程载体B;噬菌体：感染细菌的病毒;病毒与宿主关系来分： 温和性病毒 　　构建载体的好材料 烈性病毒 　　通过改造，也可用于构建载体;病毒克隆载体应用的局限性：温和性病毒和烈性病毒都存在严格的宿主专一性;一. 噬菌体;三类典型形态的病毒：;噬菌体的生命周期分为: 溶菌周期和溶源周期;烈性噬菌体的繁殖途径Phage reproductive cycle;温和噬菌体的繁殖途径;λ溶源性细菌特点： 超感染免疫性（抗御同种噬菌体再次感染的特性） 溶源性细菌可诱发进入溶菌周期(OL、OR摆脱cI阻遏蛋白后进入该周期) ;c、λ噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含双链线状DNA的颗粒，分为四个区。;线状λ噬菌体基因组的四个区：左侧区、中间区、右侧区（调控成分、复制基因O和P、溶菌基因S和R）和末端结构 （λ噬菌体的DNA在噬菌体中是线状DNA分子，基因组是一长约 48502bp 的双链DNA）;λ噬菌体cos位点;att位点 attL attR;包装限制：离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中以形成有功能的病毒载体； λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力: 上限：野生型DNA总量（48kb）的5％左右 低限：野生型DNA总量（48kb）的75％;溶菌途径：λ噬菌体感染Ecoli后，线形λ DNA注入细胞内，若进入溶菌生长途径，则粘性末端连接成环状DNA分子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制出新的λDNA，包装成子代噬菌体颗粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。;代表性λ噬菌体载体;置换型;置换型;插入型载体 置换型载体 ;插入型载体的克隆能力;置换型（取代）载体的克隆能力;(2)标记基因 噬菌斑：透明（有外源DNA插入）和混浊 α-互补现象：蓝白斑、红白斑 Spi- ：外源DNA取代red、gam基因， 能在P2噬菌体溶源性细菌中生长;宿主细胞中λ噬菌体的包装过程;头部: E蛋白占72%：头部主要组成成分 琥珀突变使λ噬菌体不能形成头部结构，导致尾部蛋白累积 D蛋白占20%: λDNA进入头部前体 以及头部成熟作用 琥珀突变使得λ噬菌体DNA不能进入头部，头部蛋白累积;λ噬菌体头部和尾部的体外??配是分开进行的;D基因缺失突变株(D-): 溶原菌菌株BHB2690 E基因缺失突变株(E-) 溶原菌菌株BHB2688 ;注意：λ噬菌载体+外源DNA的大小： 36kb～52kb 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 ;第29页/共93页;二.粘粒(cosmid);粘粒定义: 包含λ噬菌体cos位点的质粒，因此，质 粒DNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹;第32页/共93页;粘粒的特点: (1)具有部分λ噬菌体特点 体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞， 进入后环化 (2)具有质粒特点 复制、抗性 (3)高容量克隆能力 极限可达45kbp;λ噬菌体包装必备条件:;Cosmid克隆载体;pHC79;部分柯斯质粒的基本特性;柯斯质粒载体的特点： 1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒） 2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因） 3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右） 4）具有与同源序列质粒进行重组的能力 广泛应用于基因组DNA文库的构建;柯斯克隆（cosmid cloning）;(如EcoR I);M13噬菌体;M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内形成双链的复制型DNA（replication form DNA, RF DNA），可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞（噬菌体的感染位点在性散毛上）。但RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的（正好与λ噬菌体相反），因此它不存在包装限制问题。;M13噬菌体;构建M13噬菌体克隆载体的策略和途径;噬菌粒载体（phagemid vector);噬菌体;pUC119(MCS);噬菌粒载体的特点;CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统：双链DNA病毒 TMV(烟草花叶病毒)载体系统：单链RNA病毒 其他植物病毒载体系统，如单链DNA病毒：番茄金黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、玉米线条病毒、小麦矮缩病毒，以及RNA病毒：雀麦草花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、