细胞凋亡与肿瘤.pptxVIP

细胞凋亡与肿瘤;学 习 要 求;前 言;Nature Reviews, Molecular cell biology. 2001; 2: 545;P C D — Apoptosis; Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston;第7页/共159页;主 讲 内 容;主 讲 内 容;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;(dropping off , falling off) ;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;蝌蚪尾 消失;细胞凋亡特点;;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;老 化;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;第23页/共159页;第24页/共159页;第25页/共159页;;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;细胞凋亡特点;第32页/共159页;细胞凋亡与细胞坏死的区别 ;主 讲 内 容;细胞凋亡检测;细胞凋亡检测;1 光学显微镜观察 优点：光镜技术简单、快速，能短时间内 进行大样本分析 缺点：样本制备复杂、耗时 形态计数常受到主观因素干扰 重复性差 ;2 电子显微镜观察 优点：可显示凋亡细胞的许多形态学特点 尤其是膜结构和细胞器的变化 主要用于获取细胞凋亡的定性资料 缺点：样本制备复杂、耗时;细胞凋亡检测;1 台盼兰（Trypan blue）染色法 台盼兰为细胞膜非通透性活性染料，坏死细胞着色，而活细胞与早期凋亡细胞不着色 意义： 方法简单、便捷； 常常用于细胞死亡的初步评估;2 丫啶橙（acridine orange, AO）和溴化乙啶 （ethidium bromide, EB）双染法 AO和EB都能结合DNA的荧光染料，可 分别产生兰色和橙色荧光，其中 AO能透过 完整的细胞膜，而 EB 则只能染色胞膜受损 的细胞;AO/EB双染法意义 可用于荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死细胞或继发性坏死细胞 较台盼兰染色精确、详细;细胞凋亡检测;琼脂糖电泳法 琼脂糖凝胶电泳中 细胞凋亡呈现具有特征性的“阶梯” （DNA ladder）样条带外观 坏死细胞则因DNA的随机降解却常出 现弥散样外观;J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:55–63;第46页/共159页;J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:55–63;琼脂糖电泳法 缺点： 目前已被更为敏感的同位素标记、 原位末端标记技术所替代;细胞??亡检测;流式细胞仪检测（flow cytometry, FCM） 几乎所有凋亡细胞的特征性代谢、生化和分子特点都可利用FCM的单参数和/或多参数分析进行检测 优点：单个细胞分散相中辨别凋亡细胞； 快速、准确；应用范围广;第51页/共159页;细胞凋亡检测;Annexin V检测技术 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）外翻是早期凋 亡细胞的重要形态特征之一，而依 赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V则 具有与PS高亲和结合特性，将其作 为检测细胞膜表面PS的敏感探针试 剂，用于凋亡细胞检测 ;Annexin V检测技术 优点：1 对凋亡细胞进行定性及定位检测 2 同时使用膜非通透性DNA染料如 PI等，就能从Annexin V染色细 胞中将凋亡和坏死细胞区别开 来：凋亡细胞(-)，坏死细胞(+);第55页/共159页;;DNA检测技术 原理：根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中 单链的碱基缺失部分的基本原理， 应用同位素或非同位素（如生物 素，FITC等）标记的三磷酸核苷酸 （dNTP）形成新的DNA，以了解DNA 是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量;优点：常用荧光素FITC标记物，故可以 通过FCM或荧光显微镜检测相应细 胞的携带荧光强度，进行快速定