DB64 964_2014  食品中马、驴源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法.docx

ICS 67.050 X 04 宁 夏 DB64 回 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 64/T 964—2014 食品中马、驴源性成分定性检测方法 实时荧光 PCR 法 Identification of horse and donkey derived materials in food Real-time PCR method 2014 - 07 - 18发布 2014-07-18实施 宁 夏 回 族 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发 布 I DB64/ T 964—2014 前 言 本标准参照SN/T 2051-2008 《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》制定。 本标准编写格式符合GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区质量技术监督局归口。 本标准由宁夏回族自治区食品检测中心起草。 本标准主要起草人：岳苑、郭晓明、冯秀娟、高琳、贾冰凝。 1 DB64/ T 964—2014 食品中马、驴源性成分定性检测方法实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了食品中马、驴源性成分实时荧光PCR检测方法。 本方法适用于肉及肉制品中马、驴源性成分的定性检测。 该方法检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义、缩略语 下列术语和定义、缩略语适用于本标准。 3.1 术语和定义 3.1.1 马源性成分 horse-derived materials 马种属特异性DNA片段。 3.1.2 驴源性成分 donkey-derived materials 驴种属特异性DNA片段。 3.1.3 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.1.4 Ct 值Cycle threshold Ct 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2 DB64/ T 964—2014 3.2 缩略语 DNA deoxyribonuleic acid 脱氧核糖核酸。 PCR polymerise chain reaction 聚合酶链式反应。 Taq Thermus aquaticu 水生栖热菌。 FAM 6-carboxyfluorescein 6-羧基荧光素。 4 原理 本标准采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类 鉴定。本标准应用荧光检测技术鉴别马、驴源性成分，通过标记荧光物质(FAM)的特异性探针进行特异 性扩增。内参照(Internal Control)同时进行扩增，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。 观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对食品中马、驴源性成分进行快速检测。 5 仪器设备 5.1 实时荧光PCR 检测系统。 5.2 高速冷冻离心机(转速12000 r/min 以上)。 5.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.4 冰箱(2℃~8℃和-20℃或-80℃)。 5.5 微量可调移液器：0.5μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,100μL～1000μL。 5.6 恒温加热器。 5.7 可移动紫外灯。 5.8 分析天平(感量0. 1mg)。 5.9 高压灭菌锅。 5.10 干热灭菌器。 6 材料和试剂 6.1 材料 6.1.1 实时荧光PCR 反应管。 6.1.2 微量可调移液器配置吸头：10μL,200μL,1000μL。 6.1.3 离心管。 6.2 试剂 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682-2008 规定的一级水。所有 试剂均用无DNase污染的容器分装。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025-2008的规定。 6.2.1 基因组DNA 提取试剂盒’:提取步骤及使用注意事项参见附录 A。 6.2.2 荧光定量PCR 反应预混液”:使用方法及使用注意事项参见附录 B。 6.2.3 引物及探针 1) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如其他等效产品具有相同的效果，则可 使