NY_T 3859-2021CN 果品中交链孢霉菌鉴定技术规程.docx

ICS 65.020.01 CCS B 16 NY 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 3859-2021 果品中交链孢霉菌鉴定 技术规程 Technical code of practice for identification of Alternaria Nees in fruits 2021-05-07 发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I NY/T 3859—2021 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国果品标准化技术委员会(SAC/TC 510)归口。 本文件起草单位：北京农业质量标准与检测技术研究中心、中国科学院植物研究所。 本文件主要起草人：姜冬梅、李博强、冯晓元、王蒙、王刘庆、郭晓军、韩平。 1 NY/T 3859—2021 果品中交链孢霉菌鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了鲜食果品中交链孢霉菌(Alternaria Nees)的鉴定方法，包括分子生物学法(第一法)和 形态学法(第二法)。 本文件适用于鲜食果品中交链孢霉菌的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仪该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB4789.16 食品安全国家标准 食品微生物学检验 常见产毒霉菌的形态学鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR 一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术。模板 DNA 序列经高温变性为单链，适宜的 反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与两条模板 DNA 单链上相应的互补序列配对结合，在 DNA 聚合酶的作用下，以四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 为反应原料，按碱基互补配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使日 的 DNA 片段以几何倍数扩增。 3.2 GenBank 数据库 GenBank Database 美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)建立的 DNA 序 列数据库。 4 防污染措施 4.1 鉴定过程中防污染措施按GB19489、GB/T 27403 中的规定执行。 4.2 鉴定过程中的含菌废弃物需经121℃高压灭菌处理30 min 后再弃置。 第一法 分子生物学法 5 原理 采用聚合酶链式反应(PCR) 扩增样品中真菌核糖体基因内转录间隔区(ITS) 序列，并对 PCR 产物进 行序列测定，将测序结果与GenBank 数据库中的相关序列进行比对，确定样品中是否存在交链孢霉菌。 6 主要试剂 6.1 DNA 提取溶液(见附录A 中的A.1)。 2 NY/T 3859—2021 6.2 三氯甲烷-异戊醇混合液(24:1)。 6.3 Tris-EDTA 缓冲液(见附录 A 中的A.2)。 6.4 PCR 缓冲液(见附录A 中的A.3)。 6.5 dNTPs:2.5 mmol/L, 6.6 上样缓冲液(见附录 A 中的A.4)。 6.7 TAE 缓冲液(见附录 A 中的 A.5)。 6.8 DNA分子量标准：可以清楚区分100 bp～1000 bp的 DNA 片段。 6.9 Tag DNA 聚合酶。 6.10 琼脂糖；电泳纯。 6.11 液氮。 6.12 无水乙醇， 注：除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。 7 设备和材料 除分子生物学实验室常规灭菌及培养设备外，其他主要设备和材料如下： a) 高速冷冻离心机：最大转速≥10000 r/min; b) 冰箱： -20℃,2℃~4℃; c) 天平：感量0.01g; d) 灭菌锅：最大压力为0.235 MPa, 可调控范围温度为105℃~135℃; e) 旋涡混匀器：最大转速为2800 r/min; f) PCR 扩增仪：温度范围4℃~99℃,控温精度±0.25℃; g) 电泳仪：输出电压5V～600 V,输出电流2mA～200 mA; h) 凝胶成像仪：302 nm 紫外透照仪、顶置白光