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第1页/共54页蛋白鉴定分析第2页/共54页蛋白鉴定分析第3页/共54页蛋白质性质鉴定? 1 蛋白质分子量测定 DSD-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶排阻层析 电喷质谱 核磁共振 2 蛋白质等电点的测定 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 PBE-Sepharose聚焦层析第4页/共54页1概述1.1什么是蛋白质性质鉴定蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。第5页/共54页1.2蛋白质鉴定的主要参数蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。(1)蛋白质的质量鉴定(分子量)(2)蛋白质带电性鉴定（等电点）(3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体结构、肽谱、N和C-末端)(4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学)(5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应） 第6页/共54页2蛋白质鉴定方法 蛋白质可鉴定的参数很多，这里主要介绍蛋白质的分子量和等电点两个主要参数。2.1蛋白质分子量测定 早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。由于这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行测定，所以目前采用的不多了。 自从葡聚糖凝胶层析介质(Sephadex G系列产品)及排阻层析技术问世以来，就被广泛应用于蛋白质的分子量测定。它是目前实验室测定白质分子量常用技术之一。但是这种层析介质刚性较差，在层析过程流速较慢，分离时间长。 近年来又研究出刚性的耐压的凝胶层析介质，被用于高效液相色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。第7页/共54页 随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，DSD电泳成了常用的方法。从90年代初期随着毛细管电泳的出现，应用毛细管电泳无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好的选择。 蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展，给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其是采用电噴质谱测定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广，是一种快速精确的好方法。 蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致分三大类电泳技术，层析技术，光谱分析技术。第8页/共54页2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS)。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。它具有操作简单，重复性好，对样品的纯度要求不高等特点，是目前使用较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。 第9页/共54页(1)原理：a.蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。第10页/共54页b. 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂—?-巯基乙醇(?- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。第11页/共54页c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物( protein-SDS micelles)。由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，移动的速度与蛋白质本身带是什麽样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质可以测定蛋白质的分子量。第12页/共54页第13页/共54页d. 聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出