梨火疫病监测与检测技术规程.docxVIP

DB32/T XXXX—2022 PAGE I 梨火疫病监测与检测技术规程 1 范围 本文件规定了梨火疫病监测与检测的原理、监测植物、设备与试剂、病害监测、病菌检测、结果判定和报告、样品和菌株保存及无害化处理等。 本文件适用于梨火疫病监测与病菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15569 农业植物调运检疫规程 GB/T 36852 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 DB32/T 3788 梨枯梢病监测与检测技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 梨火疫病，病原为解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora (Burrill, 1883) Winslow et al., 1920），是危害梨、苹果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等蔷薇科植物的检疫性有害生物。根据梨火疫病田间症状、病菌生物学特征、致病特性、免疫学和分子生物学反应特征等进行监测和检测。 5 监测植物 梨和苹果。 6 设备与试剂 6.1 用具与仪器 采集夹、采集袋、标本夹、标本纸、修枝剪、纸袋、放大镜、镊子、刀片、标签纸、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、体视显微镜、低温高速离心机、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、微量移液器、定位器等。 6.2 试剂与材料 监测与检测过程中所有试剂、溶液及培养基配方，参见附录A。除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。 7 病害监测 7.1 监测范围 监测梨、苹果集中种植区。对疫情发生区或高风险区的果园、苗圃和采穗圃，以及从发生区或高风险区调入的苗木、砧木、接穗和花粉等进行重点监测。 7.2 田间监测 7.2.1 监测时期 每年4月~7月，重点在梨树、苹果树开花期到果实膨大中期进行监测调查，尤其是在雨后或浇水后。 7.2.2 访问调查 向当地植保员、农技员、果农、种苗和农药经销商等相关人员询问梨树和苹果树果园、苗圃和采穗圃是否有梨火疫病疑似症状（见附录B）及其发生地点、时间、危害情况等信息，判断是否存在可疑发生区。每年在花期和幼果期各调查1次。 7.2.3 踏查 对访问调查发现的可疑发生区和其他有代表性的果园、苗圃和采穗圃进行踏查，观察田间是否有梨火疫病典型症状（见附录B）。如发现典型或可疑症状的病株，立刻进行标记和拍照，取样后送实验室检测鉴定。每年在花期和幼果期各踏查1次。 7.2.4 定点监测 在踏查确认的发生区或高风险区，选择有代表性的果园、苗圃和采穗圃进行定点调查，每15 d调查1次。面积小于50亩的设置1个调查样地，面积每增加50亩增设1个调查样地，样地面积不小于5亩。在样地内采用5点取样法，每个点随机调查不少于20株，调查并统计病株率。按照附录C要求记录相关信息，并将病样送实验室检测鉴定。 7.3 调运监测 7.3.1 苗木、砧木、接穗监测 对来自疫情发生区或高风险地区的种苗、砧木、接穗按 GB 15569 要求进行抽样检查，对病样或疑似病样送实验室进行检测鉴定；对无症状样品，至少随机选取5份送实验室检测鉴定。 7.3.2 花粉监测 按GB 15569 要求进行抽样，并送实验室检测鉴定。 8 病菌检测 8.1 样品处理 8.1.1 病样和疑似病样处理 按照 GB/T 36852 要求执行。 8.1.2 无症状样品处理 先用75%乙醇对样品表面进行消毒，晾干，然后从每个无症种苗、接穗、砧木随机切取新生树皮（包含维管束部分）2 块~3 块，每块约 20 mm2，加入到装有 2 mL~3 mL 无菌水的无菌离心管中浸泡30 min，制备样品浸出液。每份花粉样品取 0.1 g，加入到装有 1 mL~2 mL无菌水的无菌离心管中浸泡30 min，制备样品浸出液。 8.2 显微镜检查 按照 DB32/T 3788 要求执行。 8.3 生物学特征观察 将样品浸出液在NA培养基平板上划线或梯度稀释分离，28℃培养24 h~48 h。挑取单菌落在NA培养基上进一步划线纯化2次～3次，获得观察记录菌落形态和其它特征，也可用透射电镜观察菌体形态、大小、有无鞭毛及鞭毛着生的位置和数目等（参见附录B）。 8.4 致病性测定 将纯化的分离物接种幼果，24 h ~48 h后观察接种部位有无坏死和菌脓产生；或接种嫩稍48 h ~96 h后，观察接种点是否出现变黑、组织干瘪、枝梢萎蔫、菌脓溢出等症状。 8.5 ELISA检测 取样品浸出液或用纯化的分离物配制成的菌悬液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用商品化ELISA试剂盒检测，按照说明书操作并进行结果判定。 8.