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基因工程：第六章第1页/共36页第2页/共36页 由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。第3页/共36页 对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。 第4页/共36页 6.1 利用表型特征选择（遗传检测法） 表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。 第5页/共36页 6.1.1 利用载体提供的表型特征选择重组体分子 1. 抗药性标记插入失活选择法 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有Bam HI和Sal I两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。 第6页/共36页第7页/共36页 利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如： 当外源DNA 插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒分子。 第8页/共36页 在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90~100%都带有pBR322重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。 第9页/共36页 此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中，也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生?-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmprTets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。第10页/共36页第11页/共36页 这种方法的优点是无需把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易超成菌落之间的相互污染，给其后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到了改善：预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后密闭保存，使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。 第12页/共36页 2. ?-半乳糖苷酶显色反应选择法 将pUC质粒转化的细胞，培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物，使菌落呈现出蓝色反应。 当pUC质粒载体的lacZ ?序列插入了外源DNA片段时，会阻断读码结构，使其编码的?肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种?-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。 第13页/共36页 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征选择重组体分子 这种选择法要求所克隆的DNA片段是一个完整的序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能的表达。其依据的基本原理是：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而