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qRTPCR生物分析检测技术; 6. 何为实时？ 7. SYBR Green I 的工作原理 8. Molecular Beacons（发夹型杂交探针）的工作原理 9. TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理 10. 多色多通道技术应用——基因表达分析 11. 内标技术介绍 三、 实时荧光定量PCR技术的应用介绍 1. 医疗方面 2. 研究方面 3. 其它方面 四、荧光定量PCR 实验室所需仪器设备清单 五、实时定量PCR 及应用于植物分子生物学的 研究;一、实时荧光定量PCR仪 热循环仪（PCR仪） 荧光检测系统 计算机及软件系统 ;不产热的光源--- 发光二极管（LED） 灵敏度高的检测器--- 光电倍增管（PMT） 优点： 不产热---无散热装置，全封闭 无机械转动装置---抗震性强 无需经常校准，耐用 灵敏度高 线性范围广 ;;第6页/共103页;二、实时荧光定量PCR的技术原理;SYBR Green I 定量原理 确定初始模板的浓度: 初始DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系：根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量;;;3. 荧光阈值和CT值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。 对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。 定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。;第12页/共103页;4. 熔解曲线 在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。 绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过程中荧光值的变化过程。 不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR GreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的???一次倒数图。 荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。 熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽：表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。;第14页/共103页;第15页/共103页;; This technology is very sensitive in that it is able to detect single copies of genes and requires very little starting material across a wide spectrum of conditions. The system monitors PCR at each cycle of a reaction, and estimates the cycle when the reaction reaches log phase increments (when the most useful quantitative information about the sample is available) Quantitation can be relative to an internal standard such as a housekeeping gene, or absolute when compared to a standard curve generated from known concentrations. ;6. 何为实时？ 试剂方面： 如何做到相对荧光强度反应的是PCR产物的相对量；如何做到相对荧光强度反应的是特定PCR产物的相对量； 仪器方面： 如何测定相对荧光强度 Opticon 实时荧光定量实PCR仪试剂 工作原理 工作原理 哪一步可以观察到荧光信号？ 变性；复性；延 伸 应用 ;第19页/共103页;第20页/共103页;7. SYBR Green I 的工作原理 SYBR Green I结合到双链DNA的小沟部 SYBR Green I染料只有和双链DNA结合后才发荧光。 SYBR GreenⅠ的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为 520nm。 在PCR反应