蔗糖酶活力测定.docVIP

一、目的 认识植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。 二、原理 本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非复原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为复原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu2+复原，复原糖自己被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm波长下有正比于复原糖浓度的光密度，进而确立蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。 三、主要仪器及试剂 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）取9个具塞试管，按表1加样： 2）向每管中加1mLNelson试剂，盖上塞子，置开水浴中20min。冷至室温，向每管中加1mL砷钼酸试剂。 3）5min后，向每管中加7mL蒸馏水，混匀。 4）在510nm下测定光密度，以复原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。 2．酶活力测定 取2g小麦苗，加入2mL乙酸缓冲液，在冰浴顶用研钵研磨成糊状，12000r/min离心10min，留取上清液用于酶活测定。取2支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5mmol/L蔗糖溶 液0.2mL，适合稀释的酶液1mL，以相同办理但不加酶液者为空白比较，室温下搁置10min。而后向每管中加1mLNelson试剂，置开水 浴中20min。冷却至室温，向每管中加1mL砷钼酸试剂，5min后，向每管中加7mL蒸