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第1页/共12页实验酪氨酸酶动力学第2页/共12页实验九 酪氨酸酶的动力学 第3页/共12页【目的和要求】1. 学会测定酶反应速度的基本方法。2.掌握测定米氏常数Km值的原理和方法。 第4页/共12页【实验原理】 酪氨酸酶催化的反应为：?475nm第5页/共12页Product Concentration A =εC d?: 3600 M-1cm-1d: 1cmTime一、酶活力测定— 酶反应初速度的测定:常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。v= dC /dt确定酶反应时间！第6页/共12页零级反应混合级反应? Vmax一级反应Km二、 底物浓度[S]对酶反应速度：Effect of substrate concentration on the initial velocity of an enzyme-catalyzed reaction.第7页/共12页 Km值测定:双倒数作图法 第8页/共12页【实验方法】 （一）酶反应初速度的测定：---酶反应时间的确定 在比色杯中，按下表依次加入试剂：L-多巴（mL）1磷酸缓冲液（mL）1.97酪氨酸酶（mL）0.03注：酪氨酸酶 5U/?l 加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取475nm处的吸光值。第9页/共12页各时刻的吸光值记录在下表：时刻（秒）A时刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255 绘制产物浓度C-Time 反应曲线，观察酶反应初速度，确定酶反应时间。一般在30~120秒左右。 第10页/共12页（二）米式常数的测定：在比色杯中，采用已确定的酶反应时间X，分别记录各管反应开始时A0和X秒钟后的A1。管号15mM L－多巴 (ml)磷酸缓冲液（ml） 酪氨酸酶（ml） 10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反应体系仍为3ml。第11页/共12页记录数据于下表：管号 L－多巴浓度（mM）A0A1ΔA（A1- A0）V（mM/min）12345 利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出Vmax和Km。 第12页/共12页感谢您的欣赏
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