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细胞工程学的学习教案第1页/共27页 目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：⑴苷类：皂苷、强心苷、干草甜苷、香豆精苷等。⑵固醇：菜油固醇、豆固醇、谷固醇、胆固醇等。⑶生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。⑷醌类：蒽醌、萘醌、泛醌等。⑸蛋白质类：氨基酸、蛋白质抑制剂、植物病毒抑制剂等。 第2页/共27页 与通过植物栽培提取代谢产物的制备途径相比，通过植物细胞培养生产有价值代谢产物具有以下优点：⑴不受季节、环境、病虫害影响。⑵不占耕地，适用于贫瘠的地方。⑶代谢产物生产可以在可控条件下进行，可以通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代谢调控提高目标产物含量。第3页/共27页 9.3.1 细胞株筛选1、适合于工业化生产的细胞株必须满足以下条件：（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快 培养周期短 不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。2、适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：（1）愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。第4页/共27页 （2）单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。（3） 细胞无性系的分离： 转移到液体培养基中进行悬浮培养 ，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。（4） 细胞株筛选：检测目标产物含量 ，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。（5 ）性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。（6）细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。 第5页/共27页 3、细胞株定向富集驯化 细胞株定向富集驯化是一种有效的筛选技术，主要包括：（1）激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。 （2）耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度的乙酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物的培养基中反复继代培养驯化，不断提高这些成分含量，可以获得耐受高剂量有毒物质的细胞株。第6页/共27页 4、人工诱变筛选人工诱变筛选系统包括：（1）悬浮培养系统 广泛用于细胞突变体的筛选。（2）愈伤组织系统 当愈伤组织培养到一定阶段后，将愈伤组织进行诱变处理，通过继代培养结合选择压力进行筛选。（3）原生质体系统 5、细胞株保存⑴继代培养保存法 悬浮培养的细胞通过每隔1—2周换液进行一次继代培养。这种方法适合于短期保种。⑵低温保存法 一般选择5--10℃的温度下培养，每隔十天左右更换一次培养液。第7页/共27页 ⑶冷冻保存 包括低温保存（-20℃）、超低温保存（液氮-196 ℃）。9.3.2 培养方法 对于植物细胞大规模培养常采用的是分批式培养、流加式培养。以分批式培养为例，一般情况下，细胞代谢产物与细胞生长的关系有3种模式:a生长偶联型：产物合成发生在细胞生长过程中，到达平台期后合成停止。b中间型：产物合成出现在细胞生长旺盛阶段，在平台期也能合成，但是速度减缓。c非生长偶联型：产物合成出现在细胞生长平台期。第8页/共27页 第9页/共27页 1、分批式培养 是一种基本的培养方式，在实验室小规模培养中广泛使用。此培养方法需重点考虑营养消耗与细胞生长、目标产物积累的关系。2、流加式培养 植物细胞流加培养时，添加的可以是限制性底物，也可以是代谢产物的前体物质或诱导子，提高细胞浓度和目标产物产量。 流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器3个单元所组成。 第10页/共27页 3、两步法培养 由于大多数植物次级代谢产物在细胞生长停止后才大量合成，即属于非生长偶联型，植物细胞培养制备次级代谢产物一般采用两步法培养工艺。 第一步采用利于细胞生长的培养基使细胞达到高的细胞浓度。 第二部更换为利于产物合成的培养基或添加代谢产物的前体物质或诱导子促进产物合成。4、两相培养 两相培养是一种有价值的产物促进释放技术。是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者第11页/共27页 具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长合成次级代谢物质，分泌出来的产物被转移至有机相中。建立植物细胞的两相培养系统必须满足以下条件：（1）添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无 毒，不会影响细胞的生长和产物的合成。（2）产物能较容易地溶解于有机相中或吸附在多聚化合物上。（3）两相间的分离比较容易。（4）有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。第12页/共27页 5、无糖组织培养技术 无糖组织培养技