WB实验步骤详细总结材料.docx

实用文档 实用文档 文案大全 文案大全 蛋白提取（所有操作在冰上进行） 裂解 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天 4℃解冻） 取 2ml 裂解液，加 20μl PMSF 混匀 称取 30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入 600μl 上述 1 中液体（加入液体与组织比例为 20：1），冰上静置 10min 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆 10s，两次（间隔 5s），冰上静置 30min 离心（在基础 4 楼 416 室） 自带 1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5 的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 将离心机预冷至 4℃为止，以 1200×10r/min 离心 15min 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至 2~3 个 0.5mlAP 管中加上样缓冲液，100℃变性 10min 仪器屏幕： S5 S5 00：10 S5 100．0 00：10 温度（℃） 时间（时：分钟） 保存 变性结束后，打开AP 管盖放一下气，然后 4℃保存，点样是取出即可用 WB 实验步骤 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 配制分离胶 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 10%分离胶的配置：（用 50ml 烧杯。1.0mm 板配 1.5 块胶，1.5mm 板配 2 块板） 5.91ml 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris? HCL 150μl 10%SDS 150μl AP（催化剂促凝作用） 9μl TEMED 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用 1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 水封 立即用 1ml 超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待 20-30min 5. 浓缩胶的配制（5%） 4.13ml 超纯水 1ml 750μl 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 Ph6.8 Tris? HCL 60μl 10%SDS 60μl AP（催化剂促凝作用） 6μl TEMED 搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10 孔或 15 孔）凝胶 30min 或 20min 电泳（电泳液最多使用两次） 安装电泳装置 低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪） 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散） Mark Mark 4μl （Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足 够 样品 8μl 7-10μl 均可内参挑齐即可 组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪 连接电泳仪 电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至 70mV，跑约 20min。（Mark 跑开，分出彩带即可） 再调电压至 120mV，跑约 60min。（不能跑过下面的玻璃板） 注：Mark 的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡 转膜（转移液可用 3-4 次） 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润） 剪 PVDF 膜（用上述滤纸，勿用手直接接触 PVDF 膜），然后用甲醇活化 10s 以上 “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方） 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动） 打开开关，调节电流至 100mA，转膜 2h（恒流）盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色 封闭 小烧杯中混匀加入皿中配制 5%脱脂奶粉： 2.5g 脱脂奶粉50mlTBST 小烧杯中混匀加入皿中 将膜取出放入上述加入了 5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min（转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用 2 次） 一抗 2l（Psmad2l）免抗1:10005μl：5ml58（分子量）2l（Psmad2l）免抗1:50010μl：5ml 2l（Psmad2l）免抗 1:1000 5μl：5ml 58（分子量） 2l