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植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 花药培养：是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。 供体植株小孢子（n） 花粉植株（n） 雄核发育 自然加倍 纯合植株DH（2n） 一年内获得纯系 常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 一、实验目的与原理 原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体培养，诱导产生再生植株。通过形态观察和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。 目的： 掌握植物花药离体培养技术； 掌握单倍体植株鉴定的方法； 了解单倍体育种的意义。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 花药培养基本流程： 预处理花药（物理或生理逆境） 收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株 选择合适的供体植株 单倍体植株鉴定 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 二、实验内容 1、镜检花粉发育时期 2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养 3、单倍体植株的鉴定 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 三、实验器材 材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 四、实验步骤 1.适期花药的选择 花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。 形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体。 ? 花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）4个时期。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 四分体时期 单核靠边期 花药切片显微观察 花粉的发育 营养细胞 生殖细胞 精子 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 四分体: 醋酸洋红染色 四分体: Alexander’s 染色 单核期 双核期 成熟花粉粒 烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 单核晚期 ?液泡 第一次有丝分裂后期 双核早期 双核中期 ?生殖核 ?生殖核 营养核? 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 处于不同发育阶段的烟草花芽 烟草花粉发育时期的确定 烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。 从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 物种 减数分裂期 草莓、番茄 四分孢子期 葡萄 单核早中期 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期 荔枝、茄子、青椒、小麦 单核早期至晚期 烟草 单核早期至双核期 梨、水稻、甘蓝 四分孢子期至双核期 玉米 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 2.花药离体培养 （1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态） （2）消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡15-30s后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在％的氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。 （3）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，但不应使花药受到损伤。 （4）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 花药培养过程 取花蕾（镜检） 预处理 取花药 消毒 接种 培养 愈伤组织发生 植物花药培养及单倍体植株鉴定工作 ① 预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。 烟草花药培养，4℃低温预处理2-3天。