免疫药实验方法以及药理实验方法学.pptVIP

（3）制备脾细胞悬液：若将取出的脾立即放入0℃冰浴，可明显降低空斑计数；在20℃以下操作，不超过15min，对空斑计数并无影响。 （4）测定抗血清的显斑常数（KD）和抑斑常数（KI），作为空斑计数的校正。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 （5）倾注底层琼脂糖时，一定要将平皿放置水平位置，以便使底层琼脂糖水平光滑。倾上层琼脂糖时，各种细胞成分要充分混匀。不能剧烈震荡，以免出现气泡。水浴温度应控制在47～49℃之间，温度过高使细胞变性；过低使琼脂糖凝固，影响细胞分散。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 2 分光光度法 【基本原理】 又称SRBC的定量溶血测定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体，较溶血空斑法精确。同时操作比较简便。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【操作步骤】 （1）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5×106/ml脾细胞悬液，或按15mg脾重/ml制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应：取试管若干只，每管依次加入脾细胞悬液、％SRBC、1∶10豚鼠血清各，充分混匀，另设不加补体的空白组。置37℃水浴中温育1h，离心3000rpm，5min。 （4）测OD值：取上清测OD413nm。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。 （2）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作适当调整。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 2、观察指标 （1）非特异性免疫功能的测定指标 （2）体液免疫功能的测定指标 （3）细胞免疫功能的测定指标 3、给药途径和剂量 4、对照实验 免疫药实验方法以及药理实验方法学 （1）组间对照 标准品对照组 弱阳性对照组 （2）自身对照 （3）配对对照 对照组 阴性对照组 空白对照组 假处理对照组 阳性对照组 免疫药实验方法以及药理实验方法学 第二节 实验方法 一、影响非特异性免疫功能实验 （一）碳粒廓清法 【基本原理】 网状内皮系统（RES）是机体最主要的防御系统，具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质。 当静脉注入特定大小的惰性颗粒后，它即可被RES细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测定血流中炭粒的消失速度来反映RES吞噬异物的能力。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【实验步骤】 （1）取小鼠，随机分组，给药。 （2）末次给药后30min，每鼠iv印度墨汁～体重。 （3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶静脉取血20ml，加到2ml 0.1%NaCO3溶液中摇匀。 （4）测OD680nm，计算廓清指数（K）、吞噬指数。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 廓清指数K＝ ＝ 吞噬指数α＝ × 即校正廓清指数 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【注意事项】 （1）印度墨汁应用NS稀释1～5倍左右，最好经超声处理后离心，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛细血管，引起动物猝死。 印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨汁颗粒大小有严格要求，过大则不被吞噬，过小则被其他吞噬细胞吞噬，如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒大小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而适用于本实验。 （2）iv要熟练，印度墨汁的剂量、取血时间必须准确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至10分钟。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【评价】 印度墨汁法测定RES吞噬活性是最经典的一种免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，结果可靠，重现性好。 若再配合小鼠腹腔巨噬细胞吞噬消化鸡红血球实验及白细胞游走实验，则可较全面地反映单核巨噬细胞系统清除异物功能状态。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 （二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法 【基本原理】 Mφ具有强大的吞噬能力，鸡红细胞对鼠类是一种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞（CRBC），隔一定时间后，吸取腹腔Mφ，镜检其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示Mφ吞噬能力的大小。 免疫药实验方法以及药理实验方法学 【实验步骤】 （1）取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分组。 （2）若筛选免疫抑制药，预先用Mφ诱导剂，可在实验前3～4天，％淀粉生理盐水溶液，每鼠。 （3）4天后，ip，5％ 。8～12h