放射免疫分析技术.pptxVIP

第1页/共21页放射免疫分析技术第2页/共21页标记免疫分析技术 用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法 检测范围生化、常规免疫mg~μg（10-3 ~10-6 g）荧光免疫、酶免疫μg~ng（10-6 ~10-9 g）放射免疫、发光免疫ng~pg（10-9 ~10-12 g）PCR pg~fg（10-12 ~10-15 g）第3页/共21页一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖1. 基本原理（1）竞争结合分析：Ag + Ab ? AgAb *Ag + Ab ? *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2. 常用标记核素：（1）125I： γ 射线，半衰期 60 天（2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年3. 测量仪器（1）γ 计数仪（2）β 液闪仪第4页/共21页4. 基本试剂（1）标准品与质控品a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b. 要求： 化学结构上——与待测物有相同的化学结构 化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低 含量准确 注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准第5页/共21页（2）标记物a. 对标记物的要求 比活度高：即单位物质的放射性强度高 生物活性及免疫活性与标记前改变小 放射化学纯度高：应 95% 稳定性好：标记的同位素不易脱落第6页/共21页b. 标记方法： 氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法： Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长 置换法： 3H 最常用c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法 最大结合百分率 标准曲线比较法e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记第7页/共21页（3）特异性结合抗体a. 对特异性结合抗体的要求： 亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度 特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低 滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高 稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定b. 抗体的制备 选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊 应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗） 选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数第8页/共21页 c. 抗体的纯化 去除杂抗体：用抗原吸附法 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化d. 抗体的鉴定 鉴定内容：效价、亲和力、特异性 鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA e. 单克隆抗体的使用： 用于 IRMA 或 RIA，特异性高 不一定优于传统的多克隆抗体第9页/共21页5. 竞争性放射免疫分析法的建立（1）反应方式a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件（2）反应体系a. 缓冲液：常用 0.05~0.1 mol/L pH 7.4~7.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲液。根据需要定b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差c. 反应时间：d. 反应温度：e. 反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体与标记的用量可扩大测定范围第10页/共21页（3）分离方法a. 对分离方法的要求： 使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全 分离后便于放射性测量 分离效果不受外界干扰因素的影响 操作简便、分离迅速、重复性好 与游离标记物的非特异性结合尽可能小 试剂来源广泛、价格低廉b. 常用的分离方法 二抗法：非特异性低，但沉淀较差 PEG 法：沉淀较好，但非特异性高 二抗-PEG 法：较好，现常用 磁化颗粒法： 固相法：现较常用第11页/共21页（4）添加剂的问题a. 防腐剂：低浓度 NaN3 对分析的影响小b. 抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响c. 抑肽酶：对一般分析无影响第12页/共21页6.