蛋白质的通性纯化和表征.pptVIP

2.蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。 当前第31页\共有68页\编于星期六\11点 当前第32页\共有68页\编于星期六\11点 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示： lg（S/So）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。 在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可改写为： lgS = lgSo – KsI = β – KsI β=lgSo为一常数，主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大， 盐析效果越好。 当前第33页\共有68页\编于星期六\11点 所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,I可用下式计算： I = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 当前第34页\共有68页\编于星期六\11点 盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于溶解度受温度影响大，故应用不广泛。 当前第35页\共有68页\编于星期六\11点 硫酸铵浓度的计算与调整方法 通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： （1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V = V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液的体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。 当前第36页\共有68页\编于星期六\11点 (2)?加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2） S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G和A为常数，与温度有关。 实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表，室温用25℃） 当前第37页\共有68页\编于星期六\11点 3.pH和温度对蛋白质溶解度的影响 pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 当前第38页\共有68页\编于星期六\11点 温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加； b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。 一般在室温下进行盐析，温度敏感的蛋白质在低温4℃进行，也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更容易盐析。 当前第39页\共有