多功能酶标仪演示文稿.pptVIP

ELISA的局限性 世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为免疫诊断应用是一个好办法，但要做好它不容易。” 1.对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善，因此，对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释。 2.固相载体的质量常不统一，主要是原料及制备工艺还不一致，致使不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能很差，影响试验结果。 3.试剂不统一，现在处于“八仙过海，各显神通”，标准还不能统一。 当前第28页\共有49页\编于星期五\18点 2.多功能酶标仪 Thermo公司全波长多功能酶标仪 50多万元 当前第29页\共有49页\编于星期五\18点 多功能酶标仪的特点 1.比色杯或者微孔板（6、12、24、48、96和384孔微孔板 ）,测样量大 ； 2. 200-1000 nm ，有紫外可见光、荧光、偏振光等,波长变化可达到1nm, 只要是有色溶液即可测定吸光度； 3.可提供终点检测、动力学、单孔扫描和光谱扫描等测读模式 ； 4.分析功能扩大。 当前第30页\共有49页\编于星期五\18点 多功能酶标仪的实验应用举例 DNA/RNA定量和纯度检测 Bradford /Lowry实验 细胞活性/细胞毒性检测 MTT分析 （IC50/LD50 ） 细菌生长分析 钙流检测 膜电位检测 双荧光素酶报告基因分析 当前第31页\共有49页\编于星期五\18点 多功能酶标仪的实验应用 ATP检测 微生物生长 绿荧光蛋白分析 药代毒性分析 膜渗透分析 荧光偏振分析 当前第32页\共有49页\编于星期五\18点 三、酶标仪操作 1. 注意事项 2. 酶标板 3. 操作要点 当前第33页\共有49页\编于星期五\18点 1.注意事项 1）反复研读试剂盒说明，熟悉操作步骤。 2）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终止的加量准确，最好使用加样枪加液以保证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。 3）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗涤5次，切要把残液甩干。 当前第34页\共有49页\编于星期五\18点 4）观察和判读吸光度结果应在15min 内完成，否则液体颜色会减退。 5）待测生物样品要放在4℃冰浴上。 6）显色液要现用现配，避光低温保存 。 7）注意购买抗体的保存。 当前第35页\共有49页\编于星期五\18点 当前第1页\共有49页\编于星期五\18点 主要内容 一、ELISA法介绍 二、酶标仪和多功能酶标仪 三、仪器操作 当前第2页\共有49页\编于星期五\18点 一、ELISA法介绍 经典的化学分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能对化学体系组分进行常量或微量分析，而对复杂生物体系的微量成分的测定往往力不从心。 在此背景下，科学家研发了一系列测定生物体系成分含量的方法，其中免疫化学法（如酶联免疫法、免疫荧光法、放射免疫法）因具有高特异性、超微量分析生物体有机成分的特点而得到迅速推广和发展。 当前第3页\共有49页\编于星期五\18点 1971年人们建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，并进行定量，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法，简称ELISA。 （Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay） 酶联免疫法的专用仪器就是酶标仪。 当前第4页\共有49页\编于星期五\18点 分析原理 酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服从朗伯比尔定律。物质的含量与显色液的颜色深浅成正比，而颜色深浅可用吸光度表示，所以物质的含量与吸光度值成正比。 酶标记抗原或者抗体发生免疫学反应后，与底物的结合物，在特定波长下有最大吸收，可通过测定显色液的吸光度对待测物进行定量。 当前第5页\共有49页\编于星期五\18点 ELISA法知识 1.免疫学知识 2.常用的ELISA分析 3.ELISA 应用 当前第6页\共有49页\编于星期五\18点 1.免疫学知识 什么是抗体？ 什么是抗原？ 什么是抗原抗体反应？ 当前第7页\共有49页\编于星期五\18点 什么是抗体(Antibody)？ 抗体是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。 当前第8页\共有49页\编于星期五\18点 免疫球蛋白（Ig） 免疫球蛋白（Ig）是机体受抗原刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物。可以阻断病原体对机体的危害，也可以引起