分子生物学常用技术简化.pptxVIP

分子生物学常用技术简化第1页/共98页第2页/共98页第十九章分子生物学常用技术第3页/共98页分子生物学技术能帮助我们干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能细胞与整体水平：基因在活体中的功能目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段第4页/共98页我们需要了解和掌握哪些基本技术？基本技术：核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用综合技术：基因工程技术转基因生物与基因敲除技术应用技术：基因诊断基因治疗第5页/共98页第一节：核酸分子杂交Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列用途：确认核酸序列间同源性对特定核酸序列进行定量自核酸混合体中辨认特定核酸序列第6页/共98页一、基本原理变性(denature)复性(renature)杂交(hybiridization)第7页/共98页核酸变性在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时任何核酸双链都将变性酸碱变性：pH3 或 pH11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性第8页/共98页变性温度Tm：melting temperature，解链温度或变性温度影响变性温度的因素：溶液的离子强度变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性DNA分子的 GC 含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24第9页/共98页核酸复性变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程复性类似与化学反应，需要一定反应时间第10页/共98页影响 DNA 复性速度的因素DNA 分子的浓度：浓度高，复性快DNA 分子的长度：长片段复性速度慢DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快不同物种C0t曲线比较　人类基因组C0t曲线第11页/共98页二、核酸探针Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记第12页/共98页1. 探针有哪些种类？DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探针，一般为双链，也可制备成单链RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测　人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列第13页/共98页2. 标记物有哪些？标记物的要求：高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列标记物的种类：放射性同位素(radio isotope)非放射性标记物(non-radioactive label)第14页/共98页放射性同位素特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素第15页/共98页放射性标记的核苷酸单体dNTP or NTP5’ or 3’ P32 labelling第16页/共98页非放射性标记物特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素地高辛：通过地高辛抗体结合并检测生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin)化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光电子密度标记物：金等重金属第17页/共98页3. 如何检测杂交信号？同位素标记物：盖革计数器、液体闪烁计数器放射自显影(autoradiography)第18页/共98页如何检测杂交信号？非放射性标记物：酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay)化学发光(chemiluminescence)第19页/共98页三、如何对核酸探针进行标记？第20页/共98页1. 缺口平移nick translation:适用于标记双链DNA控制 DNase I 的用量，可以控制探针的长度第21页/共98页2. 非放探针的酶促标记生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可以参入探针第22页/共98页3. 非放探针的化学标记利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合第23页/共98页四、如何进行杂交？样品(DNA or RNA)吸附于支持物尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等与标记的探针杂交封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行缓冲液清洗控制温度与变性剂浓度显色放射自显影/酶联显色第24页/共98页五、杂交有哪些不同的方式？斑点杂交：dot hybridizationSouthern 印迹杂交：South