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血红蛋白的提取与分离I第1页/共21页第2页/共21页凝胶色谱法 提取分离方法凝胶电泳法 课题3 血红蛋白的提取与分离（I）一、基础知识――蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。 第3页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（I）1.凝胶色谱法 （1）原理：（2）材料大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 第4页/共21页混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收 集小分子 课题3 血红蛋白的提取与分离（I）1.凝胶色谱法 （3）分离过程 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 第5页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（I）1.凝胶色谱法 （4）缓冲溶液－－洗脱剂组成：配制：作用：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。第6页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（I）2．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 影响蛋白质分子运动速度的因素第7页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（I）2．凝胶电泳法：（2）分离方法：（3）分离过程： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 第8页/共21页 血液组成成分 样品处理1.洗 涤 红 细 胞 粗 分 离2.释放血红蛋白 纯 化3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白纯度鉴定课题3 血红蛋白的提取与分离（II）二、实验操作－－实验步骤第9页/共21页血浆血细胞红细胞血红蛋白2条β-肽链 2条α-肽链亚铁血红素课题3 血红蛋白的提取与分离（II）血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。第10页/共21页吸出血浆5倍体积生理盐水3g柠檬酸钠低速离心2 min血 浆红细胞红细胞搅拌10min课题3 血红蛋白的提取与分离（II）1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：血液100mL重复洗涤3次，直至上清液没有黄色第11页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（II）2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第12页/共21页脂类物质滤纸高速离心10min 过滤烧杯离心管课题3 血红蛋白的提取与分离（II）3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液第13页/共21页1mL1mL20mmol/L磷酸缓冲液课题3 血红蛋白的提取与分离（II）4.透析血红蛋白第14页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（II）粗分离－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：教材图5－192.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱第15页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（II）2.凝胶色谱柱的装填：材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:步骤操作要求①②③④⑤固定色谱柱色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h第16页/共21页课题3 血红蛋白的提取与分离（II）3.样品的加入和洗脱第17页/共21页为什么？课题3 血红蛋白的提取与分离（II）注意事项1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡