血清学诊断技术.pptxVIP

血清学诊断技术第1页/共54页第2页/共54页 二 使用范围 新城疫、禽流感、减蛋综合征、鸡毒支原体、滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分离后的鉴定第3页/共54页三 器材1.血凝板、2.微量移液器3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液第4页/共54页?四 操作程序（一）0.5％――１％红细胞的准备 1.阿氏液(抗凝剂)的配制 葡萄糖1.866ｇ 柠檬酸钠　　0.8ｇ 柠檬酸0.055ｇ 氯化钠0.418g 蒸馏水100ml 混匀放入100 ml葡萄糖瓶内，10磅115度10分钟 高压灭菌。冷却后4℃保存备用。?第5页/共54页2.采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1份）注意:(1). 两只健康的鸡血混合; (2). 阿氏液的量要够第6页/共54页3. 红细胞悬液的配制： 将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥加99毫升稀释液）。第7页/共54页(二)．被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。第8页/共54页 (三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul）(1)抗原 一般以鸡新城疫II系或Lasota系作为已知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作 成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4℃半年 不变。第9页/共54页 2) 自制:A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原：B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日龄的鸡胚尿囊内;C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心（2000转/分钟）15分钟，取上清液;D. 作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。 第10页/共54页2.抗原血凝价的测定每种抗原做两排，结果取均值 1). 1-12孔加生理盐水25ul 2).第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1％红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟第11页/共54页 6新城疫病毒室温（18℃—22℃）作用 30分;禽流感病毒37℃作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢 新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱 7结果判定 1).完全凝集孔为终点 2).将血凝板成45°角竖立观察 3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集 4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝集,此孔稀释倍数为1个工作单位第12页/共54页鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验） (过程图)孔 号12345678910稀释倍数5102040801603206401280对照生理盐水（毫升）病毒液（毫升）4*12525252525252525252525252525252525(25)弃去生理盐水（毫升）252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置18~22℃作用45~60分钟，对照管出现结果时判定结果（举例）++++++++++++++++++++++++++++++--第13页/共54页注意 能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。 第14页/共54页 （四)红细胞凝集抑制试验 1. 抗原准备（工作浓度的准备 ） 红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成320/4=80倍稀释。 第15页/共54页2操作步骤(1) 每孔加25ul的稀释液: 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 吸取25ul于第 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 5ul弃去,第12孔为抗原对照;(3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22℃)作用30分(4) 取1％红细胞25ul加于各孔中(5) 将血凝板振荡1分钟(6) 室温作用30-45分钟（禽流感 37℃）观察结果(7) 结果判定 将血凝板呈45°竖起观察