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蛋白质工程概述第1页/共23页 生物技术制药第三章蛋白质工程概述第2页/共23页 蛋白质工程蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研究为基础，运用基因工程技术定向改造天然蛋白质，或设计创造全新蛋白质；蛋白质工程常被称为第二代基因工程；1982年：通过定点突变获得改性酪氨酸tRNA合成酶；1983年：Science发表以“Protein engineering”为题的专论。生物技术制药第3页/共23页 基因工程与蛋白质工程的区别：基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。第4页/共23页 蛋白质工程药物发展三个阶段：第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰素）第二阶段：在第一代基础上加以简单工程技术修饰（促红细胞生成素、干扰素）第三阶段：优化药物的生物学活性和理化性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白质翻译后的修饰及融合蛋白的应用）第5页/共23页 蛋白质工程的重要意义生物技术制药为蛋白质结构-功能关系研究提供强有力的而且是不可替代的手段。研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工程抗体。构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和生物传感器。改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀虫剂。第6页/共23页 二、蛋白质工程的研究内容蛋白质工程4大类研究：1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。2、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋白质变异的探讨等。3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋白质。4、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。第7页/共23页 蛋白质工程技术在新药研究中应用：提高药效活性（TNF杀伤肿瘤细胞）提高靶向性（作用于特定组织或细胞）降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组蛋白）获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分重组）其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、使之易于生产纯化，减低成本）第8页/共23页 基因DNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构预期功能生物功能mRNA转录翻译折叠DNA合成分子设计第9页/共23页 三、蛋白质工程的基本步骤分离提纯目标蛋白对目的蛋白进行氨基酸测序借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三级结构设计编码蛋白质的基因改造方案对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白产物分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用第10页/共23页 蛋白质改造常用方法生物技术制药理性方法非理性方法随机广泛突变分子重排定位突变区域性定向突变从头设计第11页/共23页 （一）定点突变改进蛋白质生物技术制药基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来改造蛋白质的方法。前提：已知蛋白质分子的结构和功能分为三类：核苷酸引物诱变 盒式诱变 PCR诱变 第12页/共23页 核苷酸引物诱变 以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短片段为引物，对单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的一个组成部分，新链便具有已发生突变的核苷酸序列。第13页/共23页 盒式诱变1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用目的基因序列中的适当限制性内切性酶酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。第14页/共23页 酶切割蛋白基因核苷酸片段新突变质粒同时获得多个突变体第15页/共23页 PCR诱变双链DNA变性 94 oC，1 min 退火，引物结合 54 oC，45 s 链延伸 72 oC，2 min第16页/共23页 生物技术制药依赖高保真DNA高温聚合酶的PCR直接点突变第17页/共23页 （二）采用融合蛋白技术改进蛋白质 概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白质基因，可实现2个基因的融合表达。第18页/共23页 调节基因启动基因结构基因