10种药物对结肠小袋纤毛虫抑杀效果研究.docxVIP

? ? 10种药物对结肠小袋纤毛虫抑杀效果研究 ? ? 孙晨阳，闫文朝，何 凯，王天奇 (河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471023) 结肠小袋纤毛虫病是毛口亚纲(Trichostomatia)、前庭目(Vestibuliferida)、小袋科(Balantidiidae)、小袋属(Balantioides)的结肠小袋纤毛虫(Balantioides coli)，简称小袋虫寄生于猪、人和非人灵长类等50 多种宿主的盲肠和结肠所引起的一种人兽共患寄生虫病。小袋虫是一种土源性寄生虫，呈世界性分布[1-3]。猪的感染较普遍，感染率达20 %～100 %，主要引起断奶仔猪腹泻，小袋虫性腹泻会加重断奶仔猪的死亡率[1,4]。人感染主要是通过吞食被包囊污染的食物或饮水，表现腹痛、腹泻、结肠溃疡和穿孔等症状[1]，还可引起人泌尿生殖道、肺和肝脏等肠道外感染[1,5]。猪是小袋虫最重要的天然宿主，人感染病例中，多数病人有与家猪、野猪或猪粪便有接触史[1]。 目前小袋虫病主要依靠硝基咪唑类药物来控制，最常用的是甲硝唑，其它药物对小袋虫病的疗效报道很少[1,6]。而甲硝唑也是治疗人和动物体内厌氧菌、阿米巴虫、滴虫和贾第虫等病原的常用药物[6-7]，临床上已经报道贾第虫、阿米巴虫和芽囊原虫对甲硝唑等硝基咪唑类药物表现耐药性[8]。在甲硝唑治疗猪和灵长类动物的小袋虫病例中，发现存在反复发作和疗效不明显的情况[6,8]。另外，甲硝唑具有致癌、致畸等毒副作用，相关法规规定禁止或限制使用此类物质作为动物食品的饲料添加剂[9]。因此，本研究选择了阿奇霉素、两性霉素、巴龙霉素、青蒿素和茴香霉素等10 种广谱的抗细菌、真菌和原虫药物，通过体外药物急性毒性试验筛选有效的抗小袋虫药物，为临床上用药物控制动物和人小袋虫病提供重要的科学依据。 1 材料与方法 1.1 药物与虫株 替硝唑葡萄糖注射液(批号为国药准字购自广东彼迪药业有限责任公司；青蒿素(Lot No.331D021)、盐酸四环素(Cat No.T8180)和两性霉素(Lot No.319A0544)均购自北京索莱宝科技有限公司；阿奇霉素(批号为国药准字购自浙江亚太药业股份有限公司；妥曲珠利(批号为兽药字CN28776） 购自拜耳(四川)动物保健公司；巴龙霉素(Lot No.H0522A)购自大连美仑生物技术有限公司；茴香霉素(Cat No.A102397)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸庆大霉素注射液(批号为国药准字购自河南润弘制药股份有限公司；氢溴酸常山酮(CAS:55837-20-2)购自武汉大华伟业医药化工有限公司。 本研究所用虫株来自洛阳市某养猪场，取自然感染仔猪的腹泻粪便，镜检可见大量的、运动活跃的小袋虫滋养体。培养前首先用适量生理盐水悬浮阳性粪样，用60 目和100 目筛网过滤除去体积比较大的杂质，滤液静置45 s，吸取悬浮液中间层含大量滋养体的液体，除去比重较大的杂质和上层杂菌，然后用改进型DMEM 培养基[10]进行驯化培养，一般换液传代2～3 次，滋养体纯度和数量即可达到药物筛选试验要求。 1.2 主要试剂 青霉素(批号为国药准字H180101)、链霉素(批号为国药准字、可溶性淀粉购自北京市海淀区微生物培养基制品厂；特级马血清(用前56 ℃灭活30 min)购自赛默飞世尔科技有限公司。 1.3 小袋虫滋养体体外扩增培养 利用改进型DMEM 培养基进行体外培养[10]，向每个高压灭菌的10 mL 西林瓶内加入2 mL DMEM 培养液和青霉素、链霉素1×104IU/mL、淀粉10 mg、特级马血清0.5 mL和含有大量结肠小袋纤毛虫滋养体粪便样品约0.5 mL，混匀后编号，在28 ℃恒温培养24 h 后，镜检可观察到大量的、运动活跃的小袋虫滋养体即可进行药物筛选试验。 1.4 小袋虫滋养体抑杀药物的筛选 选取替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、四环素、青蒿素、常山酮、两性霉素、巴龙霉素、庆大霉素和茴香霉素共10 种不同类型药物作为抗小袋虫的体外试验用药。除青蒿素不溶于水外，其它9 种药物均可用灭菌蒸馏水配制储存液。因此，采用二甲基亚砜溶解青蒿素制备储存液。 因大部分药物对小袋虫抑杀效果没有文献报道，本研究参考这些药物对细菌、真菌或原虫的治疗剂量，每一种药通过设置高、中、低3 个剂量组和不加药对照组(表1)来确定药物是否有效[11-13]。在改进型DMEM 培养基中加入数量相等的小袋虫滋养体(2 000 个/ 瓶)和高、中、低剂量的药物，混合作用6 h、12 h 和24 h 后，分别制片在显微镜下观察滋养体运动活性和数量的变化，滋养体计数方法参考本实验室已建立的方法[10]。另外，为了排除二甲基亚砜对滋