5个毛果杨PtrZFP基因的鉴定和表达分析.docxVIP

5个毛果杨PtrZFP基因的鉴定和表达分析.docx

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? ? 5个毛果杨PtrZFP基因的鉴定和表达分析 ? ? 李亚博 吕佳欣 谭 冰 高彩球 (东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室,哈尔滨 150040) 锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP)转录因子是植物中最大的转录因子家族之一。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可以将锌指蛋白转录因子分为C2H2、C4、C6、C8、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4HC3、CCCH等9种不同类型。其中C2H2型锌指蛋白是数量最多、研究最为清楚的一类锌指蛋白,该类锌指蛋白大部分在锌指区具有植物中特有的“QALGGH”保守结构,可能涉及调控植物特有的生物学功能[1]。锌指区通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合,以及与自身或其他锌指蛋白的结合,在转录和翻译水平上调控基因的表达[2~4]。 ZFP转录因子参与多种生物过程,包括转录调控,信号转导和形态发生以及生物和非生物应激反应。例如,一些植物ZFP转录因子与光信号转导有关[5]。拟南芥AtATL15基因显示出响应抗坏血酸(AsA)并在植物生长调节中发挥作用[6]。在辣椒中,CaRZFP1是可以被热诱导的C3HC4型ZFP家族转录因子,通过诱导其表达从而调控与生长有关的基因表达[7]。超表达CCCH型锌指蛋白基因AtZFP1可通过保持离子平衡,提高转基因植物抗氧化性,从而赋予其耐盐性。进一步研究表明AtZFP1可以调节一些应激相关基因的表达,如SOS1,AtP5CS1,KIN1,RD29B和RD22介导胁迫耐受性[8]。ZFP36是一种水稻C2H2型锌指蛋白,被发现可以调节晚期SOD和APX基因的表达增强了它们的活性,因此在抗氧化防御和氧化作用中发挥关键作用[8]。来自菊花的锌指基因BBX24,在调节开花时间方面起双重作用并且通过影响GA生物合成来影响植株对非生物胁迫的耐受性[9]。 研究发现,拟南芥AtZAT6蛋白可调节C2H2型锌指蛋白表达,广泛参与植物生长、发育和代谢,以及植物对低温、高盐和干旱等非生物逆境响应,拟南芥ZFP5基因通过直接调控ZFP8的表达来调节表皮毛发育[10]。水稻OsZFP1作为负调控因子,能抑制盐胁迫相关基因表达,降低转基因植株对盐胁迫抗性。同时,OsZFP1的逆境响应还受脱落酸(ABA)影响,暗示其可能参与ABA依赖的逆境响应过程[11]。 杨树是林木分子育种和基因工程研究的模式植物,并且是日常生活和生产中重要的用材树种,然而各种逆境环境严重影响了杨树的存活率和生长发育。因此通过对转录因子抗逆功能的挖掘,利用基因工程技术向杨树体内转入抗逆基因是杨树抗逆育种的有效途径。本研究从毛果杨中鉴定获得5条ZFP基因,对其序列特征和逆境胁迫后的表达模式进行分析,初步鉴定毛果杨ZFP基因是否参与抗逆胁迫应答反应,为研究和揭示林木逆境响应的分子机制提供理论基础,为杨树抗逆基因工程育种提供基因材料。 1 材料与方法 1.1 植物材料及处理方法 选取长势良好且一致的毛果杨组培苗,待生根苗长至5 cm左右时移栽到基质为3∶1(v/v)的草炭土和蛭石混合基质中,温室平均温度控制在25±1℃,光暗周期14 h/10 h,光强为400 μmol·m-2·s-1,适时浇水。待株高约为10 cm时进行胁迫处理。分别采用0.2 mol·L-1NaCl、15%聚乙二醇(PEG6000)和100 μmol·L-1脱落酸(ABA)根部浇灌处理,每48 h浇灌一次,同时浇水处理作为对照,每个处理重复3次。于处理6、12、24、48、72和144 h后,分别取各处理和对照毛果杨的根、茎、叶组织,立即放入液氮中冷冻,保存于-80℃冰箱中用于RNA提取。 1.2 毛果杨ZFP基因的生物信息学分析 从杨树基因组数据库(/)中获得5条ZFP转录因子氨基酸序列,利用ExPaSy在线Protparam软件(http://web/expasy/org/protparam/)分析获得ZFP蛋白的分子量和等电点等。利用在线软件GSDS2.0对ZFP基因的内含子和外显子结构进行分析,利用在线软件MEME对5个ZFP蛋白的保守结构域进行分析,同时对5条毛果杨ZFP基因的染色体定位情况进行研究。利用NCBI中的BLAST程序对获得的序列进行比对,搜索同源性高的其他3个物种的ZFP蛋白氨基酸序列,使用BioEdit对杨树ZFP转录因子蛋白序列进行比对分析。包括与胡杨(Populuseuphratica)、白杨(Populusalba)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)。从拟南芥基因组数据库(/)中得到132条ZFP基因的氨基酸序列,利用MEGA5.0进行系统发育进化树构建。利用ClustalX2.1和MEME对杨树ZFP转录因子蛋白序列进行基因保守元

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