LINC00963靶向miR-525-5p调控LPS诱导的牙周膜细胞损伤的机制研究.docxVIP

? ? LINC00963靶向miR-525-5p调控LPS诱导的牙周膜细胞损伤的机制研究 ? ? 喻茂文 柳建磊 汤洪波 陈建军 莫邦竹 长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通过调节微小RNA(MicroRNA，miRNA)在牙周炎的发展中发挥调节作用[2-3]。LINC00963是一种在癌症病理进展中具有重要作用的lncRNA[4]，被认为是细胞凋亡的调节因子。研究表明，LINC00963在急性肾损伤小鼠和细胞模型中高表达，敲低其表达可靶向miR-128-3p减轻急性肾损伤[5]。LINC00963在慢性肾衰竭小鼠模型中高表达，干扰其表达可抑制慢性肾衰竭造成的氧化应激[6]。MiR-525-5p在心肌梗死中下调表达[7]。miR-525-5p在脑缺血再灌注损伤中下调表达，敲低其表达可诱导细胞凋亡，增加脑梗死面积[8]。可见LINC00963和miR-525-5p可以影响细胞损伤过程，但二者在酯多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的牙周膜细胞损伤中的表达及其对LPS诱导的牙周膜细胞损伤的影响尚未可知。本研究构建了LPS刺激的人牙周膜细胞作为细胞模型，考察LINC00963和miR-525-5p对此模型中细胞凋亡和炎症因子表达的影响，并进行LINC00963的机制探索。 1 材料与方法 1.1 材料 LipofectamineTM2000、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂底物(Invitrogen,美国); PrimeScript RT试剂盒、SYBR Master Mix试剂盒(Takara,日本); miScript Reverse Transcription试剂盒、miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，德国)； si-NC、si-LINC00963、miR-NC、miR-525-5p、anti-miR-NC、anti-miR-525-5p(上海GenePharma)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(南京KeyGen)； TNF-α和IL-1βELISA试剂盒(Abcam,美国)。 1.2 细胞分离培养 收集在本院进行正畸的健康志愿者离体牙，研究获得参与者的知情同意，经医院伦理批准通过。将牙周膜组织从牙根表面轻轻刮下，根据先前的报道[9]分离人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells， hPDLCs)，将其接种到含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中生长，并保持在5% CO2和37 ℃的环境。 1.3 细胞处理与分组 取第2～3 代牙周膜细胞分为Con组(对照)、LPS组(10 μg/mL LPS诱导牙周膜细胞24 h)、LPS+si-NC组(LPS+转染si-NC)、LPS+si-LINC00963组(LPS+转染si-LINC00963)、LPS+miR-NC组(LPS+转染miR-NC)、LPS+miR-525-5p组(LPS+转染miR-525-5p)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC组(LPS+转染si-LINC00963+anti-miR-NC)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p组(LPS+转染si-LINC00963+anti-miR-525-5p)。根据制造商Invitrogen的操作规程，当牙周膜细胞达到70%～80%融合时，使用LipofectamineTM2000进行转染。转染24 h后，进行10 μg/mL LPS诱导，持续24 h。 1.4 RT-qPCR检测LINC00963和miR-525-5p表达 将Con组、LPS组和各实验组中的牙周膜细胞加入Trizol试剂提取总RNA。检测LINC00963表达时，根据说明，使用PrimeScript RT试剂盒用10 μL逆转录系统将总RNA逆转录为cDNA。qPCR实验是使用SYBR Master Mix试剂盒在ABI 7900HT定量PCR系统进行的。检测miR-525-5p表达时，根据说明，使用miScript Reverse Transcription试剂盒制备cDNA，miScript SYBR Green PCR试剂盒进行qPCR。将GAPDH和U6用作内参，采用2-ΔΔCt法计算LINC00963和miR-525-5p水平。引物如下(5′-3′)：LINC00963 F：GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT，R：ACGTGGATGACAGCGTGTGA。GAPDH F：AGTCCACTGGCGTCTTCA，R：GAG-TCCTTCCACGA