lbp基因敲除改善脓毒症大鼠肝脏炎症性损伤及其作用机制.docxVIP

? ? lbp基因敲除改善脓毒症大鼠肝脏炎症性损伤及其作用机制 ? ? 马文潇，陈姝文，刘海峰，易昕睿，王 永，贺智翔，何茂章，薛 敏，唐云书，闫 妍，程文慧，朱亚玲 脓毒症是由炎症反应引起宿主器官功能障碍的疾病，具有发病率高、病死率高等特点，是急危重症医学面临的重要临床问题[1]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又称内毒素，是脓毒症的主要致病因素之一[2]，而LPS结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)是肝脏分泌的急性反应期蛋白，可特异性结合LPS，并促进形成脂多糖/Toll样受体4/分化群14(lipopolysaccharide/toll-like receptor 4/ cluster of differentiation 14, LPS/TLR4/CD14)复合物，激活Toll样受体4/髓样分化蛋白88/核因子κB(toll-like receptor 4/myeloid differentiation-88/nuclear factor kappa-B, LR4/MyD88/NF-κB)信号通路[3]，引起炎症反应，并诱发肝脏损伤[4]。研究表明lbp基因敲除(lbp-/-)或可减轻LPS诱导的肝脏炎症损伤[5]，然而其具体的调节机制并未阐明。该研究以lbp-/-大鼠为对象，通过注射LPS刺激诱导肝损伤为模型，基于转录组测序揭示lbp基因在脓毒症相关肝脏炎症损伤发生中的作用及其机制，为脓毒症的防治提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物 10只体质量(230±20)g SPF级SD雄性大鼠，即野生型(wild type, WT)组，由北京生命河实验动物技术有限公司提供。委托南京大学-南京生物医药研究院构建与WT大鼠具有相同的遗传背景的lbp基因敲除(lbp-/-)大鼠10只，即lbp-/-组。 1.1.2主要试剂与仪器 亚致死性LPS注射液(大肠埃希菌O55 ∶B5)购自美国圣路易斯西格玛-奥尔德里奇公司；美洛昔康购自美国TargetMol公司；5%异氟醚购自上海雷门公司；TRIzol?Reagent购自美国Invitrogen公司；IL-6和TNF-α试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RNA逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。自动化学分析仪(拜耳Advia 1650)购自德国勒沃库森公司；PCR仪(2506261)购自德国Biometra公司；实时定量PCR仪(CF-X96TM)购自上海伯乐技术有限公司；石蜡切片机(RM2235)购自德国Lecia；电子显微镜(JEM1400)购自日本电子株式会社。 1.2 方法 1.2.1急性肝脏炎症损伤模型构建 动物环境符合标准的动物护理条件，大鼠可以随意饮水和进食，在实验前适应7 d。对大鼠实施麻醉(混合有3%异氟醚的氧气流量0.5 L/min)至大鼠不再有疼痛反射，注射亚致死性LPS注射液(2 mg/kg，静脉注射)，美洛昔康(0.2 mg/kg，皮下注射)用于术后镇痛。给予LPS 1 h后，用5%异氟醚处死大鼠，从其下腔静脉采血并收集肝组织。 1.2.2测定肝酶和促炎因子水平 采用生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平以评估肝损伤情况，通过RT-PCR检测促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)以评估炎症水平。 1.2.3组织苏木精-伊红染色 取大鼠肝脏组织，置于4%多聚甲醛固定24 h后乙醇梯度脱水，后在二甲苯中进行透明化处理，行浸蜡、包埋、切片、脱蜡与苏木精-伊红染色、漂洗、复染和封片等一系列常规处理后，制作组织切片。光学显微镜下观察肝脏组织形态特点。 1.2.4组织RNA测序及差异性分析 将冻存的组织经液氮研磨成粉，加入1 ml TRIzol?Reagent室温裂解细胞5 min，随后按照TRIzol?试剂说明书，提取细胞的总RNA，并将成功提取的RNA样本送至诺禾致源测序公司进行建库测序。测序得到原始测序数据(raw reads)，去除接头和低质量数据，过滤后得到待分析数据(clean reads)，使用Fastqc软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对clean reads进行质控，检查测序的整体质量，并采用STAR-2.5.3a(/alexdobin/STAR)软件将clean reads比对