不同单味中草药与其复配组方对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果.docxVIP

? ? 不同单味中草药与其复配组方对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果 ? ? 张浩然，刘琴琴，徐杭忠，王婷婷，唐 毅* (1.西南大学 水产学院/水产科学重庆市重点实验室，重庆 400715；2.淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715) 0 引言 【研究意义】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属弧菌科、气单胞菌属，是常见的革兰氏阴性短杆菌之一，为人-兽-鱼共患病病原，广泛分布于自然界各种水环境中，该菌能引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染[1-6]。目前，抗生素仍是防治养殖鱼类嗜水气单胞菌感染的有效药剂，然而长期使用抗生素会产生较多问题：一是病原菌对抗生素产生耐药性，导致治疗效果变差[7]；二是杀灭鱼体内原有的益生菌，影响鱼体内环境微生态平衡；三是药物残留[8]，进而影响人体健康。弄清常见抑菌中草药单剂与复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果，对生产应用具有重要意义。【前人研究进展】中草药具有调节养殖动物机体免疫力、杀灭或抑制细菌和病毒等作用，并因其低毒、低残留、不易产生耐药性等特点越来越受到重视。柯文杰等[9]报道了25种中草药对普通变形杆菌的体外抑菌效果。吴颖瑞等[10]研究了153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性。丁瑞[11]报道了中药抗病原微生物作用的现代研究进展。夏与晴等[12]研究了25种中草药及其联合用药配伍对5种水产养殖常见致病菌的抑菌作用。周梦等[13]报道了60种中草药对舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用。袁国尚等[14]研究了10种复方中草药对鲟源海豚链球菌的体外抑菌效果。张永花[15]报道了中草药在水产健康养殖中的作用和促进措施。姚丽等[16]研究了30种中草药对鲟鱼源海豚链球菌的体外抑菌作用。【研究切入点】未见利用常见抑菌中草药单剂与复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌抑菌效果的研究报道，结合食品安全和公共卫生需要，从传统中草药中筛选出有效的抗嗜水气单胞菌五倍子、山茱萸、诃子、大黄、乌梅和五味子6种常见抑菌中草药进行试验。【拟解决的关键问题】探明6种单味中草药与复配组方对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果，以期为抗嗜水气单胞菌感染中药组方制剂的选择提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 中草药 五倍子、山茱萸、诃子、大黄、乌梅和五味子，均购自重庆鑫斛药房连锁有限公司。 1.1.2 病原菌 鲫鱼源嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，由水产科学重庆市重点实验室分离与鉴定。 1.1.3 培养基 琼脂固体培养基和肉汤液体培养基，由水产科学重庆市重点实验室自制。 1.2 方法 1.2.1 中草药提取液的制备 将五倍子、山茱萸和诃子等6种中草药去除碎石块、砂砾等可见杂质后放入烘箱中60℃烘干，分别称取已烘干的各味中草药50 g，按料液比1∶10的比例用蒸馏水充分浸泡2 h，混合后，采用传统煎煮法，强火加热至煮沸后以文火慢煎 1 h，再用纱布和滤纸进行过滤，收集滤液，置于冰箱中 4℃保存；收集滤渣，按料液比为 1∶5的比例加入蒸馏水 250 mL浸泡 2 h，再按照上述方法煎煮约 1 h，收集滤液，合并 2次滤液蒸发至50 mL，使药液含原药浓度为1 g/mL，制成所需的6种单味煎剂[17]。 1.2.2 试验设计 将6种单味中草药煎剂以排列组合方法，按相同比例进行2剂复配、3剂复配、4剂复配、5剂复配和6剂复配，得到57种混合样液和 6种单味样液，置于4℃冰箱中保存备用。 1.2.3 指标测定 1)中草药提取液体外抑菌圈直径。牛津杯双层琼脂平板法测定供试药液的抑菌效果。无菌条件下将已灭菌的15 mL NB营养琼脂培养基倒入平板内(直径90 mm，下层)，待其凝固后再倒入约5 mL温度50℃左右并混有0.1 mL供试菌菌液(1.0×108cfu/mL)NB营养琼脂培养基(上层)，在凝固后的上层培养基表面放置牛津杯(内径6 mm、外径8 mm、高10 mm)，并轻压使之与培养基无空隙接触，杯中加入200 μL供试药液，28℃恒温培养16～18 h观察结果，采用游标卡尺从3个不同的方向测量抑菌圈直径后取平均值，3次重复；以无菌水为空白对照。 判定标准：20 mm≤抑菌圈直径，为极度敏感；15 mm≤抑菌圈直径 2)中草药提取液最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。采用试管2倍稀释法测定提取液的MIC，即取13支灭菌小试管，无菌条件下分别加入NB营养肉汤培养基1 mL，1～10号管为试验管。1号管分别加入上述中草药药液1 mL，混匀后吸取1 mL加入到2号管，依次倍比稀释至第10号管并吸取1 mL弃去，则试验组第1管至第10管的药物浓度依次为1 000.00 mg/mL、500.00 mg/mL、25