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保元汤物质基准uplc-pda指纹图谱的建立及成分指认
宝元汤是著名的古代经典方剂目录(第一批)。
保元汤的现代研究目前仅涉及到药理研究和临床应用方面,化学成分研究很少,对其指纹图谱研究至今未见报道。基于此,本实验应用现代工艺进行保元汤物质基准的制备,通过色谱技术和质谱技术对各成分进行分离鉴定研究。利用UPLC-PDA技术建立了保元汤物质基准的指纹图谱,并通过UPLC-ESI-MS/MS进一步对共有峰进行研究,指认了22个共有峰,可为保元汤质量标准的制定及成药的开发奠定基础。
1 药材来源及热价
ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪和Vion IMS Q TOF型离子淌度分析高分辨质谱仪(美国Waters公司),Quintix 125D-1 CN型1/1万电子分析天平(德国赛多利斯公司)。甘草酸铵,人参皂苷Rg
保元汤处方药材均采自道地产区,采集批次均超过25批,经中国中医科学院中药研究所陈士林研究员鉴定,人参为五加科植物人参Panax ginseng的干燥根和根茎,黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus var.mongholicus的干燥根,甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎,肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia的干燥树皮,生姜为姜科植物姜Zingiber officinale的新鲜根茎,按照2015年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)要求炮制加工,制成饮片,经鉴甄检测技术(上海)有限公司按2015年版《中国药典》要求全检,各挑选15批合格饮片,各药材产地与批号信息详见表1。将各批饮片随机组合,根据《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求(征求意见稿)》
2 方法和结果
2.1 条件1
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,ACQUITY UPLC BEH Shield C
2.2 标准物质的制备
分别取人参皂苷Rb
2.3 保元汤基准冻干粉的制备
保元汤物质基准的制备方法参照《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求(征求意见稿)》,根据明代一钱=3.73 g和一分=0.373 g折算,确定处方为人参3.73 g,黄芪7.46 g,甘草1.86 g,肉桂0.75 g,生姜1片按3 g折算。分别按表2中组合称取4倍处方量饮片,放入煎药壶中,浸泡30 min,一煎加水800 mL,煎煮60 min,二煎加水760 mL,煎煮40 min,减压浓缩后进行冷冻干燥,即得保元汤物质基准冻干粉,批号分别记为BYT01~BYT15。分别取BYT01~BYT15冻干粉约0.2 g,精密称定,置15 mL量瓶中,加50%甲醇超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,加50%甲醇定容至刻度,摇匀,经0.22μm微孔滤膜过滤,即得。
2.4 耐试验
2.4.1 酸水溶液洗脱系统
分别考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液等洗脱系统,结果表明甲酸乙腈混合液-甲酸水溶液系统的分离效果较好,进一步考察了甲酸乙腈混合液-甲酸水系统中甲酸的比例,最终确定以0.05%甲酸水溶液为流动相A,0.05%甲酸乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱的效果较好。
2.4.2 样品溶液的制备方法
分别考察了3种不同型号C
2.4.4 柱温的确定
分别在20,30,40℃不同柱温条件下考察柱温对分离条件的影响,结果表明不同柱温条件下色谱图整体变化较小,说明柱温影响不显著,拟采用柱温30℃。
2.5 方法研究
2.5.1 仪器精密度试验
取批号BYT01的保元汤物质基准,按2.3项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件连续进样6次,结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%,峰面积的RSD均≤2.0%,表明仪器精密度良好。
2.5.2 重复性试验
取批号BYT01的保元汤物质基准6份,按照2.3项下方法制备6份供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定,结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%,峰面积的RSD均≤5.0%,说明该方法重复性良好。
2.5.3 溶液稳定性试验
取同一批次保元汤物质基准,按2.3项下方法制备供试品溶液,分别于配制后0,2,8,10,16,24 h按2.1项下色谱条件测定,结果显示各共有峰在2个波长条件下保留时间的RSD均≤1.0%,峰面积的RSD均≤3.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 指纹谱的构建
2.6.1 指纹图谱的制备
按2.3项下方法制备15批保元汤物质基准供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样分析,记录色谱图,以峰面积占总峰面积0.1%进行积分,分别将203 nm和260 nm处得到的色谱图导入
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