第八章蛋白质的测定.pptVIP

第八章蛋白质的测定;第一节 概述;食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素所以只能称为粗蛋白的含量。;关于氮-pro换算等数 对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。 一般手册上列出了一部分换算等数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。 ;;具体测定方法：;;第二节 蛋白质的定性测定;第三节 蛋白质的定量测定;一、 凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。;（一）常量凯氏定氮法;;（1）消化 总反应式：;2 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。;仪器：要防止爆沸。 另外：介绍“自动回流消化仪” ;（2） 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。;（3） 吸收与滴定 1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 2 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。;① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。;④ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。;⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。; ⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在70～90℃时发黑。;二、 微量凯氏定氮法; ;三、 自动凯氏定氮法;第二十五页，共四十八页，2022年，8月28日;二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。;;注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化;5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 三．紫外吸收法 1．原理：利用蛋白质的特有基团，;2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3．主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min） 4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线;第五节 氨基酸的定性测定;第六节 氨基酸定量测定一．氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法 ; 3．双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4．操作：同时取两份样： ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。 ② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。 二者之差可计算氨基酸含量 ;（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。颜色深浅与氨基酸含量成正比，最大吸收波长为570nm. （三）电位滴定法 ;第七节 氨基酸的分离与测定 一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄