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菌种传代与保藏作业指导书 菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源 标准菌株必须购置具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻枯燥菌种〔0 代〕〔提 供菌种证书〕。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购置的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌， 接收同时应检查是 否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称， 和每一支安 瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息， 如名称、数 量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种 代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的 0 代原始菌种 储存于－20℃，有效期为三年。购置的已接种好的菌种斜面〔3 代〕应检查菌种 管是否完好。储存于 2～ 8 ℃，有效期为 3 个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及 标准储藏菌株的制备 3.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球 3.2 培 养基 改进马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副 伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 3.3 操作步骤： a.翻 开洁净工作台。 b.在安瓿的外外表用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开 〔开启安瓿时必须 小心，因为安瓿遇热时可能会破裂〕。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.5～0.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无 菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不 同菌种类型而将其培养于相应的温度 〔细菌培养温度 30～35℃，培养 18～24 小 时；真菌培养温度 23～28℃，培养 3～5 天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏 1 / 4 生长；假设不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天， 假设仍未浑浊，灭菌处理。 h.取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行 复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中参加 100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管 分装于冻存管。每个菌种制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进 行质量控制，即进行相应确实认。其余作为储藏管。黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h 项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种 中参加 20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备 10 支，按顺 序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应确实认。其余作为 储藏管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、 编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有 效期至等。 i．储藏菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 3.4 菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应 的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线别离出单个菌落。然后在 30～35℃下培 养 2～3 天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在 23～28℃下培 养 7 天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5 污染处理 假设在该平板上发现有其他菌落生长，那么说明或操作有污染或菌种不纯。将 此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新别离挑选纯菌落转接斜面菌种作 为第四代。并重新制备储藏菌种管 3.6 菌种的传代与保藏 将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复 溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻枯燥 的菌种为第 0 代，冷冻枯燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第 3 代为工 作菌种。菌种的传代次数〔自原始菌种冻干粉起〕不得超过 5 代。 菌种的传代保藏过程 3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传 第三代时取 1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工 作用菌种为第 3 代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代 (W3)，一类用于 实验用〔S3〕。 定期传代用菌的传代其操作步骤如下 〔斜面接种法〕： 2 / 4 〔1〕