DB37_T 3085-2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术.pdf

ICS65. 020.30B41DB37山長东省地方标准DB37/T3085—2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术Identification of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndromevirus strain and classical strain by RT-PCR2017-12-29发布2018-01-29实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3085—2017前言本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：杜以军、齐静、丛晓燕、陈蕾、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊时建立，I DB37/T 3085—2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术1范围本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸续合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术的操作要求本标准适用于高致病性及经典猪紧殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等，2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫4术语与定义下列术语与定义适用于本标准。4. 1PCR聚合酶链式反应。4. 2SDS十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂5.1仪器设备5.1.1微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。5.1.3电热恒温水槽。5.1.4稳流稳压电泳仪。5. 1. 5水平电泳槽。 DB37/T 3085—20175. 1. 6凝胶成像系统。5. 1. 7紫外透射反射分析仪。5.1. 8电磁炉。5. 1. 9烧杯（1000mL）5. 1. 10电子天平精度为：0.001g。5. 1. 11PCR扩增仪。5.1.12组织匀浆器或研钵。5.1. 13-20℃冰柜.5.1.142℃~8℃冰箱.5. 2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5. 2. 1Trizol.5. 2. 2氯仿。5. 2. 375%乙醇.5. 2. 4异丙醇。5. 2. 5AMV反转录酶（200U/μL）。5. 2. 6RNA酶抑制剂（40 U/μL）5. 2. 7Tag DNA 聚合醇（5 U/μL）5. 2. 81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.1。5. 2. 950×TAE缓冲液：见附录A.2.1和A.2.2.5. 2. 10焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水：见附录A.3.5. 2. 11DNA分子量标准DL2000。5. 2. 12超纯水：符合GB/T6682，三级。5. 2. 13引物：上游引物P1:5AAAGAYCAGATGGAGGAG3:下游引物P2:5TRATGGCTTGAGCTGAG3：斜体代表兼并碱基：经典毒株扩增片段长度大小为766bp，高致病性毒株扩增基因片段大小为676bp.6操作程序6. 1样品的采集和处理6.1.1样品的采集临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6. 1.2样品的处理6. 1. 2. 1取猪的脾、肺、淋巴结等组织约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨：血液3000r/min离心5min，分离血清。6. 1. 2. 2阳性对照处理：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。6. 1. 2. 3阴性对照处理：灭菌双蒸水。6.2RNA的提取-Trizol法2 DB37/T 3085—20176. 2. 1向处理好的300μL组织样品或血清中加入800μLTrizo1，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10min~25nin。6. 2. 2加入氯仿200μL，用力振荡30S，室温放置5min。6. 2. 34C，12000r/min离心15min，吸取上层液体500μL 于 1. 5 mL EP 管中。6. 2. 4加入1.0mL异丙醇，-20℃沉淀RNA至少1h。6. 2. 54℃12000r/min离心10min，弃上清，月用75%的乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC处理的灭菌双蒸水中，-20℃贮存，名备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成