细胞信号转导研究方法详解演示文稿.pptVIP

钙调素的定量测定 酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛 免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测定CaM的总量，非活性） 当前第30页\共有66页\编于星期四\7点 磷酸化的信号转导分子 酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化 蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS电泳，然而采用Western blotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。 当前第31页\共有66页\编于星期四\7点 免疫学法 蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位 免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化 流式细胞术：荧光抗体 当前第32页\共有66页\编于星期四\7点 磷酸化蛋白组学 高分辨率质谱 磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶） 当前第33页\共有66页\编于星期四\7点 激酶活性的测定 常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。 检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的活性。 PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。 当前第34页\共有66页\编于星期四\7点 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平及分子量检测 western blot analysis 信号蛋白分子在细胞内定位研究 immunohistochemistry/immunnocytochemistry Immunofluorescence（IF） Green fluorescent protein（GFP ，live cells） 当前第35页\共有66页\编于星期四\7点 western blot SDS→转膜（PVDF or NC） →封闭→一抗→洗涤→标记二抗→洗涤→显色或化学发光显影 当前第36页\共有66页\编于星期四\7点 SDS作用：确定蛋白质纯度、确定蛋白质亚单位的分子量 考染：检测含0.1ug蛋白质条带 银染：灵敏度高100倍 当前第37页\共有66页\编于星期四\7点 印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜 氨基黑染色：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：50ng） 考染：除NC膜外（50ng） 丽春红S：适用印迹膜用于二次检测（western blot） （200ng），条件摸索成熟后，不建议染色 胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记 当前第38页\共有66页\编于星期四\7点 检测目标蛋白： 结合PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测1-5ng、中等分子量的靶蛋白 上样量：目标蛋白量不应太低 膜的选择：蛋白质的分子量（孔径） 封闭液：20%BSA→10%脱脂奶粉→10%马血清 抗体：内参 检测系统：辣根过氧化物酶-ECL 结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低 Stripping buffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用 当前第39页\共有66页\编于星期四\7点 免疫荧光技术Immunofluorescence（IF） 利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光的激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子检测。 当前第40页\共有66页\编于星期四\7点 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 Co-IP（免疫共沉淀) GST pull down assay Yeast or mammalian two hybrid assay FRET （fluorescence resonance energy transfer assay) 当前第41页\共有66页